A szöveti makrofágok hatása a metabolikus betegségekre - PDF ingyenes letöltés

1 A szöveti makrofágok hatása az anyagcsere-betegségekre TÉZISGYŰJTEMÉNY a hamburgi Alkalmazott Tudományegyetem Élettudományi Kar Biotechnológiai Tanszék tudományos fokozatának megszerzéséhez Prof. Dr. Oliver Ullrich Dr. Andre Broermann benyújtotta: Christiane Dickel, 2012. november 13., kedd

2 Hamburg Alkalmazott Tudományok Egyetem Élettudományi Kar Biotechnológiai Tanszék Lohbrügger Kirchstrasse Hamburg együttműködésben: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Birkendorfer Strasse Biberach an der Riss Szerző: Christiane Dickel Beküldés dátuma: Első vizsgabiztos: Második vizsgabiztos: Prof. Dr. Oliver Ullrich Dr. Andre Broermann

3 Tartalom 1. Bevezetés. VI 1.1 Elhízás és inzulinrezisztencia. VI 1.2 Evolúciós perspektíva. VIII 1.3 Makrofágok anyagcserebetegségekben. X makrofág altípusok. X A makrofágok transzendoteliális migrációja. XIII. A CCR2 és az MCP-1 szerepe a makrofágok toborzásában. XIII 1.4 Fehérvérsejt markerek a FACS analízishez. XV 1,5 állatmodellek. XVI Az ob/ob egér. XVI A db/db egér. XVII DIO egér. XVII 1.6 A II. Típusú cukorbetegség kezelési lehetőségei. XVIII 1.7 Célkitűzés. XXII 2. Anyagok és módszerek. XXIII 2.1 Anyagok. XXIII fogyóeszközök. XXIII Felhasznált berendezések. XXIII vegyi anyagok. XXIV antitestek. XXVI állati takarmánykeverék. XXVI 2.2 Módszerek. XXVII szövet előkészítés. XXVII sejtszigetelés. XXVII sejtszám. XXVII immunfluoreszcens festés. XXVIII fluoreszcenciával aktivált sejtválogató (FACS) elemzés. XXIX III

4 2.2.6 Értékelés. XXX inzulin tolerancia teszt (ITT). XXXI orális glükóz tolerancia teszt (ogtt). XXXII citokinvizsgálat. XXXII állat. XXXIII statisztika. XXXIII 3. Eredmények. XXXIV 3.1. Az ATM-ek FACS-elemzéséhez az egér, epididymális zsírszövet feldolgozási stratégiájának kidolgozása. XXXIV 3.2 FACS módszer létrehozása a leukociták kvantitatív elemzéséhez. XXXV tandem panel (4 fős panel). Az XXXV háromszoros festéssel elemez. XXXVI kombinációs panel (4 panelből álló panel). A rendszer XLI 3.3 tesztje. XLIV leukociták a cukorbetegség genetikai modelljében. XLIV módszer összehasonlítása. XLIV elemzés 3 panellel. XLVII elemzés a kombinációs panellel. LI eredmények összehasonlítása. LII leukociták étrend által kiváltott diabetes modellben. LIII 3.4 CCR2 antagonista szubkrónikus vizsgálata huccr2 egereken. LVI leukociták. Az LVI MCP-1 vérplazma koncentrációja. LXII anyagcsere-paraméterek. LXIII 4. Megbeszélés. LXV 4.1 FACS-elemzés létrehozása az egér zsírszövetében a teljes és a gyulladáscsökkentő makrofágok számszerűsítésére. LXV tandem panel. LXV kombinált panel. LXV hármas festés. LXVI M1/M2 panel. LXVI IV

5 4.2 A módszer összehasonlítása. LXVII 4.3 Genetikai egérmodellek. LXVIII 4.4 A diéta által kiváltott elhízás (DIO) modell. LXX 4.5 Az elhízás modelljeinek összehasonlítása. LXXI 4.6 Megnövekedett ATM szám elhízott egerekben. LXXII 4.7 CCR2 antagonizmus mint terápiás lehetőség a II. Típusú cukorbetegségben. LXXIII ATM számok az anyagkezelés előtt. LXXIII A pioglitazon gyulladáscsökkentő hatása a DIO modellben. LXXIV CCR2 antagonizmus gyulladáscsökkentő hatás nélkül a herék zsírszövetében. LXXIV A zsírszövet-gyulladás és az anyagcsere-paraméterek kapcsolata ebben a kísérletben. LXXV 5. Kilátás. LXXVI 6. Összegzés. LXXVII 7. Rövidítések listája. LXXVIII 8. Ábrajegyzék. LXXXI 9. Táblázatok felsorolása. LXXXIV 10. Irodalomjegyzék. LXXXV 11. Függelék. LXXXIX 11.1 Adatlapok takarmánykeverékekhez. A mezőgazdasági takarmány LXXXIX adatlapja. A magas zsírtartalmú étrend LXXXIX adatlapja. A normál étrend XC adatlapja. XCI 11.2 FACS protokoll a Dr. Chavakis a Drezdai TU-nál. XCII nyilatkozat. XCVII köszönöm. XCVIII V

9 1. Bevezetés 2. ábra: A zsírszövet, a máj és a vérképző rendszer fejlődése az egyes szervekben emlősökben A Drosophila melanogasterben a zsírszövet, a máj és a vérképző rendszer egy zsíregységnek nevezett funkcionális egységben egyesül. A fejlődésnek ez az eredete az emlős homológok hasonló felépítésében tükröződik. A zsírszövetben lévő adipociták és a máj hepatocitáinak a megfelelő immunsejtekre, makrofágokra és Kupffer sejtekre gyakorolt hatása nagyon hasonló. Ezenkívül szoros kapcsolat áll fenn az immunrendszer és az anyagcsere-rendszer válaszai között, ami a két szövetnek az érhálózathoz való közvetlen hozzáférésében tükröződik. (Hotamisligil, 2006) 9

10 1. Bevezetés 1.3 Makrofágok metabolikus megbetegedésekben Macrophag altípusok 2003-ban először jelent meg az elhízással összefüggő inzulinrezisztencia és a zsírszövet krónikus gyulladása közötti összefüggés, amelyet makrofágok fehér zsírszövetben történő felhalmozódása formájában fejeztek ki (Weisberg et al., 2003; Xu és mtsai., 2003). A makrofágok differenciált monociták, amelyek a gerincvelő prekurzor sejtjeiből fejlődnek ki. Ezért a keringő fehérvérsejtekhez tartoznak. A monociták és a makrofágok egyaránt heterogén sejtpopulációk. Eredetileg két makrofág altípust határoztak meg: a klasszikusan aktivált proinflammatorikus M1 makrofágokat és az alternatív módon aktivált M2 makrofágokat (Gutierrez et al., 2009; Schipper et al., 2010). Normál súlyú emlősökben a leukociták megtalálhatók a zsírszövetben, a májban, az izmokban és a hasnyálmirigyben. Fenotípusuk megegyezik az M2 makrofágokéval, amelyek részt vesznek a szövetek homeosztázisában (Lumeng et al., 2007c; Lumeng et al., 2008; Odegaard et al., 2008; Olefsky & Glass, 2010; Lumeng et al., 2007b). Ennek során gyulladáscsökkentő citokineket választanak ki, például interleukint (IL) -10, IL-4 és IL-13 (3. ábra). 10.

11 1. Bevezetés 3. ábra: Makrofágok polarizációja az elhízás okozta inzulinrezisztenciában a zsírszövetben Normál súlyú körülmények között az adipociták olyan tényezőket választanak ki, mint például az interleukin (IL) -13, amely a makrofágok alternatív aktivációját indukálja. Alternatív módon aktivált (M2) makrofágok gyulladáscsökkentő mediátorokat választanak ki, például IL-10-et. Ezek a gyulladáscsökkentő citokinek pozitívan befolyásolják az inzulinérzékenységet. Az elhízás változásokat vált ki az adipocita anyagcserében és a citokinek génexpressziójában. Ez fokozott lipolízishez és a gyulladásgátló szabad zsírsavak (ffas) felszabadulásához, valamint a makrofágokat toborzó és aktiváló tényezők felszabadulásához vezet. Ilyen tényezők a monocita kemotaktikus protein-1 (MCP-1) és a tumor nekrózis faktor a (TNFα). A klasszikusan aktivált M1 makrofágok nagy mennyiségű proinflammatorikus mediátort, például TNFα-t, IL-1β-t és rezisztint termelnek, amelyek az adipocitákra hatnak, és ezáltal inzulinrezisztenciát váltanak ki. Ily módon létrejön egy önerősítő ördögi kör, amely tovább növeli a gyulladást és az inzulinrezisztenciát. (Olefsky & Glass, 2010; 2. ábra, 223. o.) 11

23 2. Anyagok és módszerek 2. Anyagok és módszerek 2.1 Anyagok Fogyóeszközök Leírás Gyártó # Termékszám. Kesztyű Nitril Kimberly-Clark # 90627 Mikroreakciós csövek eppendorf # Biztonsági zár csövek (0,5, 1,5, 2,0 ml) eppendorf # eppendorf # Pipetta hegyek eppendorf # (20, 200, 1000, 5000 µl) eppendorf # eppendorf # eppendorf # Matrix pipetta tippek Thermo Scientific # 7281 Eldobható pipetták, reagens tartály VWR # Centrifuga cső (15, 50 ml) greiner # 188271, ml-tubusok BD Falcon # mélyedésű mélyedésű BD Falcon kútlemez # Petri Dish BD Falcon # Eldobható sejtszámláló kamrák invitrogen # 10283 Vércukor-teszt tapadók Smart Swing # 21 Zellstrayner Fisherbrand # Használt készülékek Megnevezés Termék neve Gyártó Analitikai mérleg AC211S Sartorius mérleg A30 Mettler inkubátor BBD 6220 Heraeus billentõ rázógép PTR-30 Grant-bio Hûtött Heraeus Megafuge 40R Thermo Scientific pipetta 2, 10, 20, 100, 200, 1000, 5000 23 µl e

24 2. Anyagok és módszerek Mátrix pipetták 1250 Matrix Impact 2 Thermo Scientific pipettázási segédeszközök BRAND biztonsági szekrények Hera Safe Thermo Scientific asztali centrifuga 5417C eppendorf Vortexer VF2 Janke & Kunkel cellaszámláló Countess invitrogén Fluoreszcencia aktivált sejtválogató MACS Quant Miltenyi Biotech Biotech Biotech Biotech Vérmérő Cobas Integra 400 plus Roche vegyi anyagok neve Bacillol plus Gyártó # Termékszám BODE RPMI 1640 glutamin Lonza # 4464 Magzati szarvasmarha-szérum Biológiai iparágak # 04-001AUS-1A Dulbecco s foszfáttal pufferolt sóoldat Lonza # 6716 Collagenase Sigma # C0130 Trypan kék invitrogén # T10282 Futó puffer MACS puffer # Tároló oldat MACS puffer # Megoldás Fehérítő oldat MACS puffer # ammónium-klorid EDTA Sgima AG Sigma #EG kálium-hidrogén-karbonát nátrium-klorid MERCK # kálium-klorid MERCK # dinátrium-hidrogén-foszfát MERCK # magnézium-szulfát MERCK #

25 2. Anyagok és módszerek Kalcium-klorid Sigma #CG Kálium-dihidrogén-hidrogén-foszfát MERCK # Hepes Fluka # 54466 Nátrium-hidrogén-karbonát MERCK # Glucose Sigma-Aldrich # 15 896-8 Pioglitazon CCR2 antagonista Takeda belsőleg előállított hemolízis puffer 150COCOCO 4 Cl 250 Kµ EDM 10 mm: 1. megoldás (4-szeres) 137 mm NaCl 5,36 mm KCl 0,34 mm Na2HPO4 0,81 mm MgSO4 1,26 mm CaCl2 0,44 mm KH2HPO4 2. megoldás (4-szeres) 10 mm Hepes 4,17 mm NaHCO3 Keverjen össze 1 rész 1. és 2. oldatot 2 rész dupla desztillált vízzel, és a pH-t NaOH-val állítsa 7,3-ra 4 ° C-os oldat hőmérsékletén. 25-én

26 2. Anyagok és módszerek Antitestek Megnevezés Gyártó # Termékszám PE patkány anti-egér CD45 BD Pharmingen # PE patkány IgG2b, κ izotípus kontroll BD Pharmingen # APC patkány egér elleni CD11b BD Pharmingen # APC patkány IgG2b, κ izotípus kontroll BD Pharmingen # PE-Cy 7 hörcsög anti-egér CD11c BD Pharmingen # PE-Cy 7 hörcsög IgG1, λ1 izotípus kontroll BD Pharmingen # PE hörcsög anti-egér CD11c BD Pharmingen # PE hörcsög IgG1, λ1 izotípus kontroll BD Pharmingen # FITC hörcsög anti-egér CD11c BD Pharmingen # FITC hörcsög IgG1, λ1 izotípus kontroll BD Pharmingen # Alexa Fluor 700 patkány anti-egér CD45 BD Pharmingen # Alexa Fluor 700 patkány IgG2b, κ izotípus-kontroll BD Pharmingen # patkány anti-egér F4/80 antigén: FITC patkány IgG2b negatív kontroll: FITC AbDserotec # MCA497FB abdserotec # MCA1125FT FC blokk anti -Egér CD16/CD32 BD Pharmingen # Takarmánykeverékek Takarmány tartása Kliba Nafag #% kcal magas zsírtartalmú étrend Kutatási étrend # D% kcal Kontroll étrend Kutatási étrend # D12450B A takarmánykeverékek megfelelő adatlapjai a függelékben találhatók (11.1. Szakasz). 26-án

31 2. Anyagok és módszerek ATM-ek koncentrációjának kiszámítása a zsírszövetben: A makrofág százalék kiszámítása az SVF-ben: Inzulin tolerancia teszt (ITT) Az inzulin tolerancia tesztet (ITT) inzulin hipoglikémia tesztnek is nevezik, és az inzulin rezisztencia kimutatására használják. Inzulininjekció után az egészséges szervezetben jelentősen csökken a vércukor-koncentráció. Ha van inzulinrezisztencia, akkor csökken az inzulinadagolásra adott vércukorcsökkenés. Az állatokat két órával a kísérlet megkezdése előtt éheztetjük. E két óra elteltével, közvetlenül az inzulin beadása előtt, az éhgyomri érték kerül meghatározásra. Az inzulinoldatot i.p. adják az állatoknak. alkalmazott (pl. 0,5 NE/kg). Az inzulin beadása után 10, 20 és 120 perccel az állatok vércukorszintjét vércukorszintmérő csíkokkal és a Gluko Smart Swing mérőeszközével mérik. Ez a farok hegyéből származó kapilláris vér segítségével történik. 31

33 2. Anyagok és módszerek Állatok Minden állatkísérletet a tübingeni regionális tanács irányelvei szerint hajtottak végre. Az egereket kórokozóktól mentes környezetben helyeztük el, normál fényciklus alatt (12 óra világos/sötét), szabad hozzáféréssel a vízhez és az ételhez. Az állatokat Janvier-től rendelték. Ebben a projektben magas zsírtartalmú étrendet alkalmaztak inzulinrezisztencia kiváltására. Erre a célra a C57BL/6J egerek kapták a D12451 diétát (20% kcal fehérje, 35% kcal szénhidrát, 45% kcal zsír) és a hozzá tartozó kontroll étrendet D12450B (20% kcal fehérje, 70% kcal szénhidrát, 10% kcal zsír) a Research Diets-től. ugyanannyi kcal mennyiséggel táplálva a teljes statisztikában. A statisztikai elemzést a Windows Prism 5.0 verziójú szoftverével végeztük a Graphpad-tól. A t-tesztet két csoport összehasonlítására használtuk. Kétnél több csoportot tartalmazó csoportanalízishez az elemzést ANOVA és Dunnett teszt alkalmazásával hajtották végre. A 0,05 P értékeket szignifikánsnak tekintettük. A szignifikanciát a következőképpen azonosítottuk: * p 0,05-nek felel meg, ** p 0,01-nek felel meg és *** p 0-nak felel meg,

37 3. Eredmények A B C 8. ábra: A makrofág panel izotípus-vezérlése Patkány IgG2b κ-pe, Patkány IgG2b-FITC és Patkány IgG2b κ-apc A-val Az SSC FSC elleni dot blotjában egy P1 kaput (piros) határozunk meg, amely az SVF-t mutatja. Az ebből a P1 kapuból származó B PE és FITC jeleket tovább elemezzük a dot blotban. Mindkét címke szempontjából pozitív populáció CD45 + F4/80 + (zöld). C Ezeket a kettős pozitív sejteket ábrázoljuk az APC jelükkel szemben a hisztogramon, és a pozitív jel (rózsaszín) az SVF hármas-pozitív makrofágjait ábrázolja. Meghatározunk egy specifikus CD45 + F4/80 + sejtpopulációt (7B. Ábra). A kettős pozitív sejteket megvizsgáljuk az APC csatornán a specifikus CD11b pozitív jel szempontjából (7C. Ábra). Ezek a hármas-pozitív sejtek makrofágok. A megfelelő izotípus-kontroll a várakozásoknak megfelelően csak nagyon alacsony, nem specifikus jelet mutat mind a PE/FITC dot blot (8B. Ábra), mind az APC hisztogram (8C. Ábra) számára. 37

39 3. Eredmények ABCD 10. ábra: A proinflammatorikus makrofág panel izotípus-szabályozása Patkány IgG2b κ-PE, Patkány IgG2b κ-apc és Hamster IgG1 λ1-fitc A -val Az SSC FSC elleni pontblottjában egy P1 kaput (piros) határozunk meg, amely az SVF térképeket. B Ennek a P1 kapunak a PE jelét tovább elemzi a dot blot. A CD45 pozitív sejteket (kék) kapuzva kapjuk, és a C-t a hisztogramon mutatjuk be APC jelükkel szemben. A pozitív jelet (rózsaszín) ezután D-re kapuzjuk a FITC jelhez képest. Az SVF (zöld) tripla-pozitív proinflammatorikus makrofágjai így elemezhetők. Az anti-cd45 antitest PE szignálja két pontfelhőt mutat, amelyek egyértelműen elkülöníthetők egymástól (9B. Ábra). Két világosan meghatározott csúcs is látható az APC hisztogramján (9.C ábra). Az izotípus kontrollban egyik csatornában sincsenek nem specifikus kötések (10B. És 10C. Ábra). A kettős pozitív sejtek azonban magas háttérzajt mutatnak a fluoreszcencia-emisszió szempontjából a FITC csatornában (9D. Ábra). Az összes nem specifikus jel azonban kizárható a beállított kapun keresztül (10D. Ábra). 39

41 3. Eredmények Az F4/80 + CD11b + sejtek külön sejtpopulációt alkotnak a FITC/APC diagramban (11B. Ábra). Ezek a kettős pozitív makrofágok negatív és pozitív jelet is képeznek a PE hisztogramban (11C. Ábra). Mind a makrofág kapuban, mind a kapuzott CD11c + sejtek izotípus-szabályozásra szolgálnak jel nélkül (12B. És 12C. Ábra) Kombinációs panel (panel 4-ből) Mivel az antitest panel négy elemének elemzése nagy előnyökkel jár, mint például alacsonyabb antitestfogyasztás és kevesebb idő, mint a makrofág és a proinflammatorikus makrofág panel két háromszoros festésének elemzése azt jelenti, hogy az F4/80-FITC, CD11b-APC és CD11c-PE panelt Alexa Fluor 700 jelzéssel ellátott anti-CD45 antitesttel bővítettük. A 13. ábra a négy alkalmazott címke emissziós spektrumát mutatja. Ezeknek a fluorokrómoknak a kombinációjának lehetõvé kell válnia, mivel az emissziós spektrumok nem fedik át a maximumukat. 13. ábra: A FITC, PE, APC és Alexa Fluor700 kombinációs panel (4 panelből álló panel) fluoreszcencia spektruma 41

42 3. Eredmények A makrofágok és a proinflammatorikus makrofágok elemzésének eredményül kapott kapuzási struktúráját az alábbiakban mutatjuk be (14. ábra). A megfelelő izotípus kontroll a 15. ábrán látható. A B C D 14. ábra: A négyutas ellenanyag panel kapuja CD45-Alexa700, F4/80-FITC, CD11b-APC és CD11c-PE A-val Az SSC FSC elleni pontfoltjában egy P1 kapu (piros) van meghatározva, amely az SVF-et képviseli. Az ebből a P1 kapuból származó Alexa Fluor700 és FITC jeleket tovább elemzi a dot blot. Mindkét címke szempontjából pozitív populáció CD45 + F4/80 + (kék). Ezeket a kettős pozitív sejteket ábrázoljuk az APC-jelükkel szemben a hisztogramban C-ben, és a pozitív jel (rózsaszín) az SVF hármas-pozitív makrofágjait reprezentálja. Az SVF CD11c pozitív proinflammatorikus makrofágjai, amelyek a zöld kapun keresztül kapuk, közvetlenül összefüggésbe hozhatók ugyanazon minta SVF makrofágjaival egy mérés során. 42