A TASK-1 és a Pannexin-1 hiányos egerek szívfenotipizálása - Ingyenes PDF
A TASK-1 és pannexin-1 hiányos egerek szívfenotipizálása INAUGURÁLIS ÉRTEKEZÉS a Dr.med.vet fokozat megszerzéséhez a Justus Liebig Egyetem Állatorvosi Tanszékén Giessen Stella Schulte (szül. Petrić)
Beküldte a Justus Liebig Egyetem Farmakológiai és Toxikológiai Intézete Gießen Témavezető: Prof. Dr. Joachim Geyer és a Düsseldorfi Egyetemi Klinika Gyermekkardiológiai és Pneumológiai Klinikájáról Témavezető: Prof. Dr. Birgit Donner A TASK-1 és pannexin-1 hiányos egerek szívfenotipizálása INAUGURAL DISSERTATION Dr.med.vet fokozat megszerzésére a Giessen-i Justus Liebig Egyetem Állatorvosi Tanszékén, Stella Schulte (született Petrić) állatorvos Freiburg Gießen 2016-ból
A Justus Liebig Egyetem Állatorvos-tanszékének jóváhagyásával Gießen dékán Prof. Dr. Dr. Kramer Martin bíráló Prof. Dr. Joachim Geyer Prof. Dr. Birgit Donner Disputation Day, 2017. május 10
A bevezetési hullám metszi az izoelektromos vonalat (Mitchell és mtsai, 1998; Chaves és mtsai, 2003; Swynghedauw és Aubert, 2003; lásd az 1.6. Ábrát). R R R R P S Q R R R R T-hullám vége (repolarizáció vége) P S 1.6 ábra: A T-hullám végének kézi meghatározása egérrel. Mitchell és munkatársai, 1998-ból módosítva. A T hullám és az izoelektromos vonal metszéspontját a repolarizáció végeként definiálják. Q Az egér fiziológiai nyugalmi pulzusszáma 550-620 ütés/perc körüli (min -1; Takuma és mtsai, 2001; Kass és mtsai, 1998), ami lényegesen magasabb, mint az embereké, átlagosan 70 ütés/perc (Doevendans et al., 1998; Silbernagel és Despopoulos, 2003). A PR, RR, QRS és QT intervallumok ennek megfelelően rövidebbek az egereknél. Összefoglalva elmondható, hogy a szív cselekvési potenciálja és anatómiai felépítése, valamint a két faj ioncsatorna-expressziója marginálisan különbözik egymástól, de ennek ellenére lényegében lehetővé teszi a kutatási eredmények egérből az emberbe történő átadását. A tudás jelenlegi állása szerint minden bizonnyal a legjobb az alapkutatás minden lehetséges rendszere közül. 9.
Bevezetés 1.5.3 A knock-out egerek felhasználása, fejlesztése és lehetőségei A knock-out egerek fejlesztésének előkészítő munkája az amerikai Mario Capecchit és két brit kutatótársát, Sir Martin Evans-t és Oliver Smithies-t kapta a 2007. évi orvosi Nobel-díjjal. Eddig a kopogtatott egerek az egyetlen olyan lények, amelyeket olyan transzgenikus technikák alkalmazásával hoztak létre a laboratóriumban, amelyekben egy vagy több gént sikeresen és specifikusan kikapcsoltak. Ezek elveszítik funkciójukat, és lehetővé teszik a kutatók számára, hogy következtetéseket vonjanak le (örökletes) betegségekben betöltött szerepükről. Két tenyésztési vonalunkkal, a pannexin-1 és a TASK-1 egerekkel rendelkezünk ilyen kísérleti egerekkel. Mindazonáltal az eredmények emberre való átvitelének utolsó kérdése mindig megmarad. 10.
Bevezetés 1.5.4 Kiütéses egerek előállítása 1. Sejtkultúra (embrionális őssejtek, ES) 1.7. Ábra: Kiütéses egerek előállítása Graw, 2007 szerint módosítva. Célvektort transzfektálunk embrionális őssejtek sejttenyészetébe és homológ rekombinációval beépül az őssejtek DNS-be. A megváltozott sejtek szaporodásának eredményeként végül egy megváltozott génnel rendelkező sejtpopuláció jön létre, amelyet az egér blasztocisztáiba injektálnak. Ezeket a blasztocisztákat embriótranszfer útján nőstény egerekbe illesztik be és hordozzák. A született egerek vagy kizárólag normális (vad típusú) genetikai anyagot hordoznak, vagy úgynevezett mozaikegerekként a fele vad típusú, a másik fele pedig genetikailag manipulált. Az utóbbiak heterozigóták. A heterozigóta egerekkel történő keresztezés végül homozigóta kiütési egereket eredményez. 11.
Bevezetés ES2-247 ES1-84 CE-395 CE-494 IS-169 CE-379 IS = sejten belüli hurok; ES = extracelluláris hurok; CE = karboxi-terminális vég (az egyes számok után a transzmembrán domének aminosav-helyzetét mutatják) 1.9. Ábra: Az egér három különböző pannexin-génjének szerkezeti összehasonlítása Módosítva Penuela és mtsai., 2009 szerint Az egér mind a 3 pannexin-génje 4 transzmembrán doménnel rendelkezik (mindegyik 20 aminosav-végből áll), valamint 2 extracelluláris hurok és egy intracelluláris karboxi- és amino-terminális vég. A pannexin-2 karboxi-terminális vége sokkal hosszabb, mint a másik két pannexiné. 1.6.2 A pannexin-1 expressziója és működése A pannexin-1 az egyetlen a három pannexin fehérje közül, amely mindenütt kimutatható (Barbe és mtsai., 2006); expressziója különösen erős az eritrocitákban, az endothel sejtekben és az asztrocitákban, ahol felszabadulnak ATP-k érintettek (Wang et al., 2007). Kifejezését az egér szívében (Ray és mtsai, 2005; Nishida és mtsai, 2008) növeli a nyomás (Nishida és mtsai, 2008). Az egér szívén kívül a pannexin-1 kimutatható volt a kutya kardiomiociták szarkolemmájában is (Dolmatova et al., 2012). 15-én
Bevezetés Az átmenet és a refrakter periódusok mellett jelen munka a TASK-1 +/+ és a TASK-1 -/- egerek sebezhetőségének elemzését is célozza in vivo programozott oktapoláris katéterekkel egy elektrofiziológiai vizsgálatban (EPU)., intracardialis stimuláció meghatározható. 25-én
Anyag és módszerek 2 Anyag és módszerek 2.1 Pannexin-1 és TASK-1 WT és KO egerek genotipizálása 2.1.1 DNS-készítés farokcsúcsokból A DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) DNS-előállítását kb. 3 mm hosszú csont nélküli farokcsúcsok, amelyeket a füljelzéssel egyidejűleg elválasztáskor eltávolítottak az egerekből. Szövetminta A sejtfalak feloldása A DNS-mosási folyamat megkötése 2.1. Ábra: A DNeasy Blood and Tissue Kit kézikönyve szerint módosított DNS-készítmény elve Az első lépés során a proteináz K feloldja a sejtfalakat, és így felszabadítja DNS-jüket. A különféle pufferek lehetővé teszik az optimális DNS-kötést a speciálisan szállított csövek DNEasy membránjához. Két mosási eljárás végső soron a használhatatlan anyag és az enzim inhibitorok eltávolításához vezet, és a tiszta DNS felhasználásra készen eluálódik. Elúció Felhasználásra kész DNS-tisztaságot és a DNS-koncentrációt fotometriásan határoztuk meg (NanoDrop 1000, Thermo Scientific, USA). 26-án
Anyag és módszerek látható gerjesztése. Általános szabály, hogy azokon a felvételeken volt a legvilágosabban látható, amelyekben a pitvari gerjesztés amplitúdója majdnem olyan magas volt, mint a kamraé. Köteg gerjesztése Atrium (A) A Kezdet: pitvari jel V Kezdet: kamrai stimuláció (V) 2.6. Ábra: Csomagmérése pannexin 1 +/+ egérben. Érzékelés (jelfelvétel) e3e4-gyel Az His-köteg akkor ismerhető fel a legjobban, ha a pitvari és kamrai gerjesztés amplitúdója hasonlóan magas volt az intracardialis felvétel során. Ha találtak egy csomó gerjesztését, minden egérnél hat egymást követő szívdobbanást rögzítettünk az AH (pitvari stimuláció kezdete a His kötegig) és a HV (a kamra ingerlésének kezdetéig) és az AV intervallum (pitvar kezdete egészen Kamra gerjesztés kezdete). Ezt hat pannexin-1 és öt mindkét genotípusú TASK-1 egérrel hajtottuk végre. Az állatonkénti átlagértékeket statisztikailag értékeltük. 38
Anyag és módszerek 2.8 Telemetriai vizsgálatok pannexin-1 +/+ és pannexin-1 -/- egereken 2.8.1 Alapok Egerekben a hosszú távú EKG csak szubkután vagy intraperitoneálisan elhelyezett távadók segítségével rögzíthető. Ezek jó módszer a nehezen fenntartható pihenő pulzusszám elérésére egerekben a kábítószer hatása nélkül (Bernstein, 2003; Berul 2003). Az EKG jeleket két elektróda rögzíti, továbbítja a vevőlemezekre, egy mátrixszűréssel (mindkét DSI Data Sciences, Minneapolis, USA) szűri és végül a számítógépes program (LabChart 7) teszi láthatóvá. 2.8. Ábra: Telemetriai adóink Az általunk szubkután beültetett távadók (ETA-F10 modell a DSI-től). 1 3-6 hónapos és legalább 23 g tömegű hím és nőstény pannexin-1 WT és knockout egereket alkalmaztunk a kb. 1,6 g nehéz adó szubkután beültetésére (DSI Data Sciences, Minneapolis, USA) használt. A rágcsálóknál szokásos módon minden állat szabad hozzáférést kapott élelemhez és vízhez, amíg az érzéstelenítést kiváltották. 1 http://www.datasci.com/products/implantable-telemetry/mouse-(miniature)/eta-f10 43
Anyag és módszerek 2.8.2 Előkészületek a transzplantátor beültetéséhez Amint az állatok elérték az érzéstelenítés stádiumát a ketamin és a xilazin intraperitoneális injekciója után, fekvő helyzetben rögzítettük őket egy melegedő lemezen (HAT 007, Minitüb GmbH, Tiefenbach). Végtagjait az utóbbihoz tapadó csíkokkal erősítették, míg a kiszáradás elleni védelem érdekében a szemet kereskedelmi forgalomban kapható szemkenőcsökkel (pl. HYLO -Gel, Ursapharm, Saarbrücken) kezeltük. A kísérleti állatokat latex gázálarcon keresztül 0,5 l/perc oxigénnel (Linde AG, Pullach) és 1,5 térfogat% izofluránnal (Isofluran Actavis, Actavis, München) láttuk el. Kifejezetten erre a célra készített plexi szívóeszközön voltak, amelynek állítólag meg kellett volna akadályoznia az izofluránt tartalmazó levegő kiszökését. 2.9. Ábra: Egér a műtőasztalon Egér a plexi szívóeszközön és a fűtőszőnyegen. A kék latexdarab gázálarcként szolgált. Ezen előkészületek során a steril távadót és 5% -os glükózból és fiziológiás sóoldatból készült 1 ml-es kevert fecskendőt előmelegítettük vízfürdőben. 44.
Anyag és módszerek A vizsgálatok végén az egereket leöltük, a telemetriai adókat eltávolítottuk, megtisztítottuk és fertőtlenítettük a Gigazyme és a Gigasept oldatokkal (Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt). 2.8.5 Hosszú távú EKG-k rögzítése Kramer et al. (1998) a távadó beültetése után tíz nappal elkezdtük rögzíteni a 24 órás EKG-kat. Annak érdekében, hogy ne okozzon irritációt vagy viselkedésbeli változásokat, az állatok a felvétel során egyes ketrecekben maradtak. Az EKG-felvétel napjain ügyeltek arra, hogy elkerüljék az emberek szokatlan expozícióját és a zajokat az állati helyiségben, hogy a fordított nappali-éjszakai ritmust ne zavarják. Az EKG-felvételhez szükséges összes eszközt, mint például a laboratóriumot, a PC-t, a monitort, a lemezeket, a dobozt és a különféle tápkábeleket, alaposan fertőtlenítették, mielőtt az adott állatszobába vitték (Incidin Liquid, Ecolab, Monheim). Az adatokat a LabChart 7 szoftverrel (ADInstruments, Spechbach) és 1 kHz mintavételi frekvenciával rögzítettük. PC elemző szoftverrel Adó Input-Matrix Receiver 2.11. Ábra: A hosszú távú EKG felvétel sematikus ábrázolása módosítva: Kramer, 2000 47
Anyag és módszerek 2.8.7.1 Úszás Az úszási kísérleteket (SV) a kísérleti állatgyógyászatban állandó mozgással járó mozgásnak tekintik, amely szubmaximális erõfeszítéshez vezet (Bernstein és mtsai, 2003). Öt percig tartó pihenő EKG telemetrikus felvétele után az állatok további öt percig külön-külön úsztak egy II-es méretű Makrolon ketrecben (15 cm magas, csapvízzel töltve 37-39 C-on). Ha az egyes állatok kimerültség miatt víz alá kerültek, akkor azokat manuálisan rövid ideig támogatták. Az EKG-t az úszás során és az edzés utáni 10 perces időszakban rögzítették, amikor az egerek visszatértek ketreceikbe. 2.12. Ábra: Egér úszás közben kézi támogatással Az értékeléshez az úszási kísérletet három szakaszra osztottuk az alábbiak szerint: 1. táblázat: Az úszási kísérlet időzítése Fázis Időtartam (perc) 1. tevékenység 0–5 Pihenés 2 5–10 Úszás 3 10–20 Helyreállítás 2.8.7.2 Futópad gyakorlása A futópad használata az emberek és más nagy emlősök kontrollált szív- és érrendszeri stresszének aranystandardja 49
Anyag és módszerek Tartsa fenn a járási sebességet lejtéssel vagy anélkül, és fejezze be, amikor az állatok kimerültek (Desai és mtsai, 1999; Kemi és mtsai, 2002; Massett és Berk, 2005; Niebauer és mtsai, 1999). Az első futópad I protokollunk lejtés nélkül (lásd a 2. táblázatot) egyenes futási útvonalra korlátozódott, amelynek során a sebességet a fáradtság megjelenéséig folyamatosan növeltük. 2. táblázat: Futópad I. protokoll lejtés nélkül Idő (perc) A második II. Futópad protokollt lejtéssel legkorábban 2 nappal az első után hajtották végre, hogy az állatok megújulási időt biztosíthassanak. A sebesség folyamatos növekedése mellett négy lépésenként 5 lépésben 0-tól 25-ig emelkedést hajtottak végre (lásd a 3. táblázatot). Sebesség (m/perc) Idő (perc) Sebesség (m/perc) 0 2 20 13 2 3 22 14 4 5 24 15 6 6 26 16 8 7 28 17 10 8 30 18 12 9 32 19 14 10 34 20 16 11 36 21 18 12 38 22 3. táblázat: Futópad protokoll II lejtéssel Idő (perc) Sebesség (m/perc) Rámpa beállítása (fok) Idő (perc) Sebesség (m/perc) Rámpa beállítása (fok) 0 2 0 16 10,2 20 2 3 "18 11,4" 4 3,3 5 20 12,5 25 6 4,5 "22 13,7" 8 5,6 10 24 14,8 "10 6,8" 26 15,9 "12 7, 9 15 28 16,5 "14 9,1" 30 17,7 "51
ANYAG ÉS MÓDSZEREK Közvetlenül a kimerültség kezdete után az állatokat visszahelyeztük ketreceikbe, és az EKG-jukat a 10 perces gyógyulási fázisban rögzítettük. Minden egér esetében megjegyeztük a megtett távolságot és a fáradtság pillanatában mért sebességet. A gyógyulási szakasz mindig megfigyelés alatt zajlott, és minden rendellenességet észleltek. 2.14. Ábra: Egér az egyenes futópadon Ha mindkét futópad protokoll és a kapcsolódó helyreállítási fázis véget ért, az állatokat méhnyak diszlokációval leöltük. Ezután a test paramétereinek meghatározására használták őket. Az úszási teszthez hasonlóan a futópad teszteket is három különböző szakaszra osztották az értékelés céljából: 4. táblázat: Mindkét futópad teszt időzítése Fázis időtartama (perc) 1. tevékenység 0–5 Pihenés 2 5–10 Futópad 3 10–20 Helyreállítás 52
Anyag és módszerek A nagy képkockasebességnek és a jó térfelbontásnak köszönhetően most már lehetséges a magas pulzusszámú kicsi egér szívének echokardiográfiai vizsgálata is. Az echokardiográfiát a Vevo 2100-zal (FUJIFILM Visual Sonics Inc., Toronto, Kanada) és egy MS 400 lineáris, 18-38 MHz-es átalakítóval végeztük. 14 pannexin-1 +/+ - és 12 pannexin-1-hiányos egérben mért értékenként átlagoltunk 10 szívdobbanást. 2.15. Ábra: Az általunk használt ultrahang készülék 2 Az egereket legkorábban tizenkét nappal az adó beültetése után vizsgáltuk echokardiográfiával. 2.9.2 Az echokardiográfia elvégzése Az anesztézia indukcióját 5% izofluránnal (Isoflurane Actavis, Actavis, München) és 0,5 l/perc oxigénnel (Linde AG, Pullach) végeztük, és az oxigénáramlás állandó értékével 1,5% izofluránra csökkentettük. Annak érdekében, hogy az érzéstelenítő gáz hatása a szív- és érrendszerre a lehető legkisebb legyen. Az állatok csak mozdulatlanok legyenek. A vizsgálat céljából az egereket a hátukra helyezték a test hőmérsékletére előmelegített Vevo rendszer fűtött lemezén, amely egyben mozgatható asztalként is szolgált. 2 www.visualsonics.com/vevo2100 54
Anyag és módszerek lefektetve. Ebből a célból a mancsait ragasztószalaggal rögzítették az érzékelőkön az EKG rögzítéséhez, a fejét a gázálarcba helyezték, és a test hőmérsékletét rektális érzékelővel figyelték. Annak érdekében, hogy az ultrahang képek a lehető legtermékenyebbek maradjanak, az egereket a mellkas területén borotváltuk (Contura, Wella, Darmstadt). 2.16. Ábra: Egér echokardiográfia során A tesztállat az echokardiográfia során egy melegedő asztalon fekszik, és maszkon keresztül érzéstelenítő gázt (izofluránt) kap. Monitorozás céljából végtagjait ragasztószalaggal rögzítik az EKG érzékelőkhöz, és egy rektális érzékelő (kék) rögzíti a test hőmérsékletét. A jobb áttekintés érdekében első képként a párhuzamos hosszú tengelyt választottuk. Ebben a beállításban rögzítették az aorta áramlását, az aorta szelep gyűrűjének átmérőjét, a szív hosszát és az M-módot a falvastagság mérésére. 55
Anyag és módszerek 2.17. Ábra: A diasztolés szívhossz és a szív belső kerületének mérése a paraszternális hosszú tengelyen. amely embernél és egérnél a legjobb eredményhez vezet (Collins és mtsai, 2001; Devereux és mtsai, 1986). A bal kamra hosszát az endokardiális csúcstól a mitrális gyűrűig mérjük, és M-módot állítunk elő a papilláris izom szintjén (Collins et al., 2001). A következő második beállítással, a rövid tengellyel 3 különböző B módú vágási síkot mentettünk el a csúcs, a középpont és az alap területein. Ehhez az endokardiumot manuálisan körözték a szisztolában és a diasztolában mindhárom vágási síkban. 2.18. Ábra: Rövid tengely B-módban (bal kamra) Középen fekete = a szív lumenje, körülötte világosszürke = endokardium, sötétszürke = szívizom 56 Jobb kamra
Anyag és módszerek 2.11 Statisztikai értékelések Az összes kísérlet adatait átlagértékként (MW) ± standard deviációként (SD) mutatjuk be, és az egerekből (n) származnak, amelyeket az egyes kísérletekben kifejtettek. Attól függően, hogy mi felel meg a kérdésnek, a statisztikai szignifikanciát a párosítatlan t-próbával, az egyirányú ANOVA-val vagy a lineáris regresszióval számoltuk. P értékével