A tea-katechin epigallokatechin-gallát hatása az egér energia-anyagcseréjére - PDF Ingyenes
Német Táplálkozástudományi Intézet (DIfE) Potsdam - Rehbrücke, Farmakológiai Tanszék Munkacsoport Energiacsere-élettan Fizika a tea katekin epigallokatechin gallátról az egér energia anyagcseréjére Doktori fokozat megszerzéséhez értekezés (Dr. rer.nat.) A Potsdami Egyetem Matematika és Természettudományi Karán .-Táplálkozástudomány Maika Friedrich született: 1978. november 1., Magdeburg Potsdam, 2010. február
Ezt a művet a Creative Commons licencszerződése alapján licencelték: Hozzárendelés Nincs kereskedelmi használat Nincs adaptáció 3.0 Németország A licenc feltételeinek megtekintéséhez kövesse a következő hivatkozást: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/Online közzététel a Potsdami Egyetem kiadói szerverén: URL http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2010/4815/ URN urn: nbn: de: kobv: 517-opus-48159 http: // nbn-resolving .org/urn: nbn: de: kobv: 517-opus-48159
mrna MRP NaOH NEFA NMR pa PAS PC PCR PDB PDE PDHx PEPCK PIG-B PK messenger Ribonukleinsav Többféle gyógyszer rezisztencia fehérje Nátrium-hidroxid nem észterezett zsírsav nem észterezett zsírsavak Nukleáris mágneses rezonancia posztabszorptív Periodikus sav Schiff festék Periodikus reakció Schiff Piruvát-dehidrogenáz-komplex Foszfoenol-piruvát-karboxiláz-Fenol-izoamil-alkohol-guanidinium-izotiocianát- merkaptoetanol Karboxiláz SD Normál étrend SGLT1 Nátriumfüggő glükóz transzporter 1 SO szubsztrát oxidáció StK Metabolikus ketrec TG Triglicerid TM szárazanyag UCP szétválasztó fehérje VO 2 Oxigénfogyasztás WAT fehér zsírszövet WHO Egészségügyi Világszervezet VII
Bevezetés A polifenolok a flavonoidok, amelyek viszont flavanolokra és katechinekre oszlanak. A zöld teában lévő katechinek a szárazanyag 30% -át teszik ki. Ezeket a következőképpen különböztetik meg: (1-2. Ábra): epikatechin (EC), epikatechin-gallát (EKG), epigallokatechin (EGC) és epigallokatechin-gallát (EGCG). Strukturális különbségek merülnek fel a hidroxilcsoportok számában és a galloilcsoport jelenlétében. Az EGCG az összes katechintartalom akár 50% -ának részesedésével is a zöld tea domináns katechinje. A katechinek mellett a zöld tea fehérjéket (15%), rostokat (26%), egyéb szénhidrátokat (7%), lipideket (7%), ásványi anyagokat (5%), aminosavakat (4%) és pigmenteket (2%) (Cabrera) tartalmaz. és mtsai., 2006). 1-2. Ábra: A zöld tea fő összetevőinek kémiai szerkezete (Koo & Noh, 2007) A zöld tea másik összetevője a koffein, amely kb. 3 6% -ot tesz ki (Yang & Landau, 2000). Egy csésze zöld tea 20 és 100 mg EGCG és 20 40 mg koffeint tartalmaz (Stangl et al., 2006; Khokhar & Magnusdottir, 2002). A különféle teakatechinek biológiai aktivitása eltérő, az EGCG mutatja a legnagyobb aktivitást (Chen et al., 1997). A teakatechinek közül a három szénatomon található a legtöbb hidroxilcsoport, amelyek fontosak a hidrogénvegyületek képződéséhez. Az EGCG molekulában található galloilcsoport kölcsönhatásba léphet más molekulákkal is, pl. B. Írja be a gyököket (Liao, 2001). 14-én
A bevezetőben különös érdeklődés kísérte az EGCG polifenol vizsgálatát, amely túlnyomórészt a zöld teában található meg. Az irodalomban leírt számos hatást hosszú távú alkalmazás után figyeltek meg. Nem világos, hogy a hosszú távú vizsgálatok változásait közvetlenül az EGCG okozza-e, vagy közvetetten a zsírcsökkentés eredményeként. Az alkalmazás rövid vagy középtávú időtartamát választották ezért az itt végzett vizsgálatokra, amelyek során a testösszetétel változása még nem nyilvánult meg egyértelműen. Ennek a munkának a célja az volt, hogy részletesen megvizsgálja a tea polifenol EGCG hatását az energia és a szubsztrát anyagcseréjére rövid és középtávú alkalmazás után. Az egeret azért választottuk vizsgálati modellnek, mert az EGCG biológiai hozzáférhetőségét tekintve az ember és az ember is meglehetősen hasonló. A cél az volt, hogy megtudja, milyen hatással van az EGCG az egér modell különböző élettani paramétereire rövid és középtávú alkalmazás után. A rövid és középtávú alkalmazás utáni energia- és zsíranyagcserét az energiaegyensúly szempontjából és molekuláris szinten is meg kell vizsgálni a lehetséges mechanizmusok feltárása érdekében. 23.
Anyag és módszerek 2-2. Táblázat: A félszintetikus, magas zsírtartalmú étrend tápanyagforrásai Összetevők [g/100 g] 3. kísérlet (lásd 2.2.3.3) 4. kísérlet (lásd 2.2.3.4) kazein 1 20 18 Búzakeményítő 2 40 43 Szacharóz 3 5 5 Pálmamag zsír 4 18 Lenmagolaj 5 1 Pórsáfrányolaj 6 1 Kukoricaolaj 7 17 Cellulóz 8 11 7 Ásványi keverék 9 5 5 Vitamin keverék 10 2 2 Víz, ml 30 30 Energiatartalom [kj/g] 19,9 21,3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Állandó tejüzem Peiting GmbH, Landshut (86% nyersfehérje) Kröner GmbH, Ibbenbüren/Westfahlen Nordzucker GmbH, Uelzen OTHÜNA, Ostthüringer Nahrungsmittelwerk Gera GmbH, Gera LARU Langensiep & Ruckebier GmbH, Bottrop Kunella Feinkost GmbH, Cottbus Mazola Unilever Soehett Deutschland GmbH GmbH, Rosenberg Mineral-Trace Element C1000/100 g: kb. 930 mg; P 730 mg; Mg, 80 mg; Na, 440 mg; K 710 mg; S 170 mg; Cl, 360 mg; Fe, 20 mg; Mn, 10 mg; Zn, 3 mg; Cu, 800 mg; J, 40 mg; F, 400 mg; Se, 20 mg; Co, 10 mg (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage) C1000-vitamin premix 100 g-ra: A, 0,45 mg; Kolekalciferol, 1,13 mg; K3, 1 mg; Tiamin, 2 mg; Riboflavin, 2 mg; B-6, 1,5 mg; B-12, 3 mg; 5 mg niacin; 5 mg pantoténsav, 1 mg folsav; Biotin, 20 mg; Kolin-klorid, 100 mg; 10 mg p-amino-benzoesav; 10 mg inozit; E, 16,4 mg (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage) 26
Anyag és módszerek 2.2.3 Vizsgálati tervezés Az EGCG hatásainak vizsgálatához több állatkísérletet hajtottak végre, különbözõ vizsgálati tervekkel. 2.2.3.1. 1. kísérlet: Az EGCG energia- és anyagcsere paraméterekre gyakorolt rövid és középtávú hatásának vizsgálata Ebben a kísérletben meg kell vizsgálni az EGCG alkalmazás rövid és középtávú hatásait az energia-anyagcsere, különösen az energia-anyagcsere paramétereire. Ennek érdekében két részvizsgálatot hajtottak végre (2-2. Ábra). 2-2. Ábra: Az EGCG hatásának vizsgálata az egerek energia-anyagcseréjének paramétereire rövid (1A) és középtávú (1B) alkalmazás után. A testösszetétel meghatározása nukleáris mágneses rezonancia (NMR) spektroszkópia segítségével (lásd: 2.2.5) ITK közvetett állat-kalorimetria; Az energiaforgalom paramétereinek meghatározása (lásd: 2.2.6) SO szubsztrát oxidáció stabil izotópok segítségével (lásd: 2.2.7.1) StK t metabolikus ketrec elpusztítása 27
Anyag és módszerek 2-4. Ábra: 13 C felhalmozódás a kiválasztott szervekben és szövetekben, valamint a kilégzett levegő egerekben, miután átálltak a szokásos étrendről (SD) 13 C zsírtartalmú étrendre (HFD); DOB = Delta a kiindulási EGCG-teszt fölött Az előzetes teszt egy hetes táplálási periódust eredményezett a 13 C beépülés meghatározására az EGCG alkalmazásától függően. Az egerek itt is SD-ről félszintetikus HFD-re váltottak, amely kukoricaolajat tartalmazott egyetlen zsírforrásként (2-5. Ábra). Az alapokat a 2.2.7.2. Pont ismerteti. Az EGCG-t a takarmánnyal együtt adtuk be (csoportok: kiindulási csoport (SD), kontroll, 0,25%, 0,50% EGCG (HFD), n = 8). 2-5. Ábra: A dietetikusan megjelölt trigliceridek 13 C-beépülésének vizsgálatának vizsgálata egerekben A testösszetétel NMR-meghatározása NMR-spektroszkópia segítségével (lásd 2.2.5.) Légzőgázminta a 13 C-dúsítás IRMS segítségével történő meghatározásához megölni 30-at
30 l/h készlet. Az állandó környezeti hőmérséklet (22 C) fenntartása érdekében a légzőketreceket klimatikus szekrényekben helyezték el (Vötsch Industrietechnik, Reiskirchen-Lindenstruth). Az O 2 fogyasztás (VO 2) és a CO 2 termelés (VCO 2) arányát minden állatnál 6 perces intervallumban határoztuk meg. Az Eq. 2-2 (Frenz, 1999). Az egereknek 16 órakor adták az ételt, hogy megvizsgálják az EGCG hatását abszorpciós és étkezés utáni körülmények között. A rövid távú vizsgálatban az etetést kombinálták az orális EGCG alkalmazással. 36
Anyagok és módszerek A lemezt pipettázzuk, hozzáadunk 150 µl enzimreagenst (RGT), összekeverjük és centrifugáljuk. 10 perc inkubációs idő után szobahőmérsékleten, a minták és a standard kihalását mértük a reagens vakhoz (víz) 500 nm-en (Power Wave 340, BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall). A plazmaminták koleszterin koncentrációját a standard sorozat lineáris regressziós egyenlete (2-19. Egyenlet) segítségével számítottuk ki. ymxn (2-19 egyenlet) yxmn az y tengellyel metszett egyenes vonal kihalási koncentrációjának lejtése 2.5.1.2 Szabad zsírsavak Alapelv A plazmában található szabad zsírsavak mennyiségi meghatározását a NEFA-C teszttel végeztük (Wako Chemicals GmbH, Neuss) . A reakcióelvet a következő egyenletek mutatják be (2-20. És 2-22. Egyenlet). R COOH Acyl CoA szintetáz ATP CoA SH Acyl CoA AMP PP i (2-20 egyenérték) Acyl CoA O Acyl CoA Oxidase 2 2,3 transz-endol CoA H2O2 (2-21 egyenérték) peroxidáz 2 H2 O2 4 Aminophena zóna MEHA Kinon imin 4 H2O (2-22 egyenérték) R-COOH ATP CoA-SH AMP PP i zsírsavak adenozintrifoszfát koenzim A adenozin monofoszfát foszforsav 50
Anyagok és módszerek ΔE vak (E2 E1) vak 2 (E3 E2) vak (2-29 egyenérték) ΔE minta (E2 E1) 2. minta (E3 E2) minta (2-30 egyenérték) Először is a három különbség Az extinkciós méréseket (E1-E3) meghatároztuk a minta és a vak értékekhez (2-29 - 2-30 egyenérték). Ezután kiszámítják a minta és a vak érték közötti különbséget (2-31 egyenlet). ΔE ΔE minta ΔE vak érték (2-31 egyenlet) A koncentrációt ezután a rétegvastagság felhasználásával számítottuk a következő egyenlet szerint (2-32 egyenlet): c β HB V MW β HB ε dv 1000 ΔE g/l (2 -32) V végtérfogat (ml) MW molekulatömeg -HB (104,1 g/mol) formazán extinkciós együtthatója 492 nm-en (19,9 l mol -1 cm -1) d rétegvastagság (1 cm) v mintatérfogat (ml) a triplikátok számított koncentrációját átlagoltuk, és a plazmaminták 1: 2 arányú hígítását vettük figyelembe. 2.5.2 A trigliceridek meghatározása a májban A máj trigliceridtartalmának meghatározásához a triglicerideket először HB pufferral extraháltuk. A kivont triglicerideket ezután meghatározhatjuk a triglicerid-meghatározó készlettel (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen). 55
Anyag és módszerek TE-puffer Tris-HCl EDTA autoklávban, azaz 2 O pH-érték beállítása 8,0, autokláv 10 mm 1 mm 10xMOPS MOPS nátrium-acetát EDTA pH 5,5 7,0; autokláv (színváltozás sárgára) 200 mm 50 mm 10 mm 1xMOPS - elektroforézis puffer 10xMOPS ad 1 l autoklávozott dh 2 O-val 100 ml denaturáló puffer 10xMOPS 100 µl 37% formaldehid 175 µl 50% formamid 500 µl ad 1 ml autoklávozott dh 2 O futópuffer glicer 500 µl autoklávozott dh 2 O 400 µl 10xMOPS 100 µl spatula csúcs bróm-fenol-kék etidium-bromid hígítás 0,1% etidium-bromid 50 µl autoklávozott dh 2 O 950 µl 2.6.4 Az RNS tisztítása DNáz-emésztéssel Az RNS lehetséges genomiális szennyeződésének minimalizálása érdekében A TURBO DNS-mentes készlettel (Ambion/Applied Biosystems, Darmstadt) tisztított RNS-kivonatokat. Ehhez kb. 10 µl RNS-t (5-40 µg RNS között) összekevertünk 7 µl DEPC-vel kezelt vízzel, 2 µl Turbo DNase pufferrel és 1 µl DNázzal 30 percig 37 C-on, termikus ciklusban (Peltier Thermal Cycler PTC-200, MJ Research Inc. (Waltham, MA, USA). Ezután 2 µl DNáz inaktiváló reagenst adunk a 65-öshöz
Anyag és módszerek 2-12. Táblázat: A hígítási sorozat cdna-mennyisége az alapozó hatékonysági koncentrációjának meghatározásához 1 0,05 koncentráció 2 0,20 koncentráció 3 1 koncentráció 4 5 koncentráció 5 20 koncentráció 6 50 cdna mennyiség [ng] A hígítási sorozat (x-tengely) logaritmikus kezdeti koncentrációi a CT-értékekkel (y-tengely) szemben egy regressziós vonalat eredményeztek, amelynek növekedésével a hatékonyság kiszámítására került sor (Eq. 2-40, Vaerman et al., 2004). A hatékonyság általában 85-100% volt. E 10 1/m 1 (egyenlet: 2-40) A génexpresszió relatív kvantitatív meghatározása egy referencia génre történő normalizálást követően történt (itt: 18SrRNS, 2-41. ΔC T CT ('célgén) CT (18SrRNS) (2-41 egyenlet) A kiszámított CT értéket ezután levontuk a 36 fiktív értékről (2-42 egyenlet). Feltételezzük, hogy 36 C értéknél a 18SrRNS nem amplifikálódik, mivel a reakció körülményei (pl. Primer koncentrációk, MgCl 2 koncentráció) a PCR végén már nem optimálisak. ΔΔC 36 T ΔC T (2-42 egyenérték) Az exponenciális CT értékeket lineáris formává alakítottuk át a 2. bázis erejére emelve (2-43 egyenlet). Relatív génexpresszió 2 C T (2-43 egyenlet) 72