A transzkripciós faktor Olig2 genomikus kötőhelyek azonosítása akutan tisztított PDGFR-ben; Sejtek által
Összegzés
Itt bemutatunk egy protokollt, amelynek célja az oligodendrocita 2 (Olig2) transzkripciós faktor (Olig2) genomszintű kötésének elemzése akutan tisztított agyi oligodendrocita progenitor sejtekben (OPC) alacsony sejtes kromatin immunprecipitáció (ChIP), könyvtár előkészítés, nagy áteresztőképességű szekvenálás segítségével. és az adatok bioinformatikai elemzése.
Absztrakt
Bevezetés
Fontos a fehérje (vagy fehérje komplex) DNS kötődésének és az epigenetikus markerek tanulmányozása, hogy transzkripciós szabályozó hálózatokat építsünk fel különböző biológiai folyamatokban. Különösen a transzkripciós faktorok és a genomi DNS közötti kapcsolatok játszhatnak fontos szerepet a gének szabályozásában, a sejtek differenciálódásában és a szövetek fejlődésében. Ez egy hatékony eszköz a kromatin immunprecipitáció (ChIP) transzkripciós szabályozásának és epigenetikai mechanizmusainak tanulmányozásához. A következő generációs szekvenálási technológia gyors fejlődése miatt a fehérje-DNS-kötődés és az epigenetikai jelölések elemzését 1 ChIP-ben alkalmazzák, nagy áteresztőképességű DNS-szekvenálással (ChIP-Seq) párosítva. A standard ChIP-Seq protokollhoz azonban reakciónként körülbelül 20 millió sejtre van szükség, ami megnehezíti ezt a technikát, ha a sejtek korlátozottak, például izolált primer sejtek és ritka sejtpopulációk.
Az oligodendrocita törzssejtek, beleértve az oligodendrocita progenitor sejteket (OPC) és az oligodendrocyták, az egész agyban elterjedtek, és nélkülözhetetlenek az agy fejlődéséhez és működéséhez. Az őssejtek egyik típusaként az OPC-k önmegújulhatnak és megkülönböztethetők. Az OPC-k nemcsak az oligodendrocyták progenitoraként szolgálnak, hanem fontos szerepet játszanak az idegi jelátvitel terjedésében más típusú agysejtekkel folytatott kommunikáció révén 2. Korábbi tanulmányok szerint a nemre jellemző transzkripciós faktorok, például az Olig2 és a Sox10 3, 4 szabályozzák az oligodendrocita fejlődését. Ezek a transzkripciós faktorok a szervező vagy az enhancer régiókban helyezkedtek el, hogy néhány kulcsfontosságú gént megkötjenek expressziójukhoz, miközben befolyásolták az oligodendrocita specifikációját és differenciálódását. Azonban nehéz meghatározni a DNS-kötő fehérje (vagy fehérjekomplex) érdeklődését az akutan tisztított primer OPC-k iránt, nagyon korlátozott számú sejttel.
Ez a protokoll leírja, hogyan lehet szisztematikusan feltárni az Olig2-vel immunprecipitált genomi DNS-t tisztított egér OPC-kben, az egész genom szintjén, ChIP-Seq technika alkalmazásával. Az egéragy OPC-kat akutan megtisztítottuk immuntervezéssel és ChIP-kísérletben in vitro disszemináció nélkül. Korlátozott számú OPC nyerhető immuntervezéssel, és ez elegendő a standard ChIP-Seq kísérletekhez. Alacsony sejtes ChIP-Seq protokollt írunk le, amelynek transzkripciós faktorok esetében ChIP-reakciónként 20 ezer sejtje van. Röviden, a térhálósított sejteket lizálták és ultrahanggal ultrahanggal kezelték, amely kromatint nyírt. A nyírt kromatint Olig2 antitesttel és protein A-val bevont gömbökkel inkubáltuk az Olig2 antitesthez kötött genomi DNS kicsapására. A protein A-val bevont gyöngyök elúciója és reverz térhálósítása után a genomi DNS-t Olig2 antitestekkel kicsapjuk és fenol-kloroform extrakcióval tisztítjuk. A kapott terméket mennyiségileg meghatároztuk, és T-tailing, alapozó fénysablon váltás és bővítés, adapterek és megerősítés hozzáadása, könyvtárméret-választás és tisztítási lépéseknek vetettük alá a ChIP-Seq könyvtár építéséhez.
A szekvenálás után elemeztük az Olig2 transzkripciós faktor antitestekkel előállított minta nyers értékeinek minőségét és a kontrollmintát. Alsóbbrendű alappárok és adapterek leolvasott töredékekkel, amelyeket levágtak. Ezután a levágott leolvasásokat az egér referencia genomjához igazítottuk. Azokat a genomi régiókat, amelyek szignifikánsan gazdagodtak a ChIP-leolvasásokhoz, csúcsnak tekintettük a kontroll mintához képest. A lehetséges transzkripciós faktor-kötőhelyeket képviselő jelentős csúcsokat leszűrtük és vizualizáltuk egy genom böngészőben.
Az ebben a protokollban leírt módszer főleg nagy mértékben alkalmazható ChIP-Seq esetében más transzkripciós faktorokból, korlátozott számban bármelyik sejttípussal.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
Minden állatfogyasztási és kísérleti protokollt a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató szerint hajtottak végre, amelyet a Houstoni Texasi Egyetem Egészségügyi Tudományos Központjának Intézményi Biológiai Biztonsági Bizottsága és Állatvédelmi Bizottsága hagyott jóvá.
1. PDGFRα pozitív oligodendrocita sejt sejtek tisztítása egér agyából (módosítottuk a fent leírt 5., 6., 7. immuntervezési protokoll alapján)
(2) Low-Cell-ChIP előkészítés és ChIP könyvtár létrehozása nagy áteresztőképességű szekvenáláshoz
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
A kezdeti minőség-ellenőrzési értékelést követően az adapterek nyers leolvasása és vágása, valamint az alacsony minőségű alappárok visszaszorítása a 4. ábra minőség-ellenőrzési diagramjaiLátható. A levágott olvasások alapminőségének 30-nál nagyobbnak kell lennie, nincsenek adapter szekvenciák és alacsony a duplikáció (4b. Ábra)-D.). A jó minőségű vágott leolvasások növelik az igazítás teljes sebességét. Más paraméterek, például a GC-tartalom is fontosak, és ezeket figyelembe kell venni a vágásnál.
Párosított ChIP-Seq adatok használata esetén a fragmensek bizonyos távolságra elválnak az átírási faktor körül. A páros végű szekvenálás lehetővé teszi az átlagos fragmens hosszának pontosabb becslését, és jobb becslést ad azokról a genomi régiókról, ahol több kötés történt. A szálkorrelációs diagram a dúsulás csúcsértékét mutatja, amely megfelel az uralkodó fragmens hosszának. Mint az 5. ábrántalált fragmentum hossza 130 bp, míg az olvasás 50 bp-ot vesz igénybe. A ChIP-Seq adatkészlet, ahol a fragmens hossza hosszabb, mint az olvasmány, kiváló minőséget jelez 16 .
A Silico-ban a ChIP-Seq kísérlet kiegészítő módszerei a motívumdúsítás elemzése és a de novo motívumkeresés. Mivel az Olig2 kötődését OPC-kben korábban nem vizsgálták, Olig2 ChIP-Seq eredetű csúcstalálkozó motoneuron progenitor sejteket és embrionális őssejteket használtak a de novo motívum azonosításához 4, 24. Az OLIG2 de Novo azonosított motívumokat felvették az átfogó ENCODE motívum adatbázisba 25, és elvégezték a motívumok dúsításának elemzését. A de novo által azonosított OLIG2 motívumok és az ismert transzkripciós faktor (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 és ASCL1) motívumok magas dúsulását találtuk a PDGFRα tisztított sejtek ChIP-Seq csúcsaiban. A 30 de novo gazdagítása azonosítja a motívumokat egy E értékkel 7. ábra mutatja az Olig2 két legfrissebb de novo azonosított motívumát. Ezt a két de novo módon azonosított Olig2 motívumot az ismert motívumok mellett a ChIP-Seq csúcsokból kinyert,> 60% -os PDGFRα tisztított sejtekben találtuk.
Vita
A megtisztított OPC-k térhálósítása után a térhálósított sejteket jéghideg HBSS-oldattal kell mosni, és a ChIP további lépéseit 4 ° C-on kell végrehajtani, különben az antitest nem képes megfelelően kicsapni a genomi DNS-t.
A következő fontos lépés ebben a protokollban a könyvtár előkészítése. A könyvtár építéséhez a ChIP anyag PCR-amplifikációját használtuk. A könyvtár előállításához szükséges PCR-ciklusok száma a DNS mennyiségétől függ. A könyvtár előkészítéséhez a kapott DNS mennyiségének pontos számszerűsítése szükséges. Túl sok vagy kevés PCR-ciklus befolyásolhatja a könyvtár koncentrációját, valamint a PCR-artefaktumokhoz vezető komplexitást.
Nehéz létrehozni a ChIP-Seq könyvtárat, ha korlátozott számú sejtje van az immunprecipitációhoz 27. Az eddig használt standard ChIP protokollhoz 10 ng immunprecipitált DNS-ChIP-Seq könyvtár előkészítése szükséges, 1, 28. Az itt leírt protokoll azonban általában 20 000 OPC-ből származó Olig2 antitesttel 2 ng immunprecipitált DNS-t generál. DNS-t használnak a ChIP-Seq könyvtár előállításához egylépéses adapteres módszerrel, amely lehetővé teszi a jobb érzékenységet, lehetővé téve az immunprecipitált DNS pikogramjainak amplifikálását. A kereskedelmi készleteket ötvözve ez a protokoll praktikus megoldást kínál a ChIP-Seq végrehajtására transzkripciós faktorokhoz kis számú sejt alapján.
Fontos, hogy a leírt alacsony sejtes ChIP-Seq protokoll alkalmazható más transzkripciós faktoroktól származó primer sejtekben vagy ritka sejtpopulációkban lévő ChIP-Seq-re is. Az ebben a protokollban használt antitesteket kísérletileg ellenőrizni kell, hogy először egy adott IP-kísérletet hajtsanak végre. Az antitestek nem specifikus kötődése gyenge eredményekhez vezet. Ezen túlmenően ajánlott ezt az alacsony sejtes ChIP-Seq kísérletet olyan sejtekben végezni, amelyekben a kívánt transzkripciós faktor magas expresszióval rendelkezik.
Az adatok elemzéséhez nehéz lehet eldönteni, hogy mely értékeket használjuk cutoffként a csúcsszűrés meghívása után. Az elemzés céljától függően szigorúbb vagy lazább paraméterek is használhatók. Jellemzően a rekesz dúsítás és a p-érték vagy az FDR kombinációját alkalmazzák. Ha korábban néhány transzkripciós faktor kötőhelyet ismertek a vizsgálat során, ez segíthet a szűrési küszöbök meghatározásában. A nyilvánosan elérhető ChIP-Seq kísérletekből különböző sejtvonalakban és körülmények között végzett transzkripciós faktort megkötő weboldal adatbázisokat állítottuk össze 29, 30. Meg lehet keresni egy gént, és ellenőrizni lehet, hogy előzőleg találtak-e transzkripciós faktor kötőhelyeket. Fontos azonban tudni, hogy a transzkripciós faktor kötőhelyei sejttípustól és körülményektől függően eltérnek.
A Silico-ban a ChIP-Seq-Experiment további módszerei a motívumdúsítás elemzése és a de novo motívumkeresés a MEME-ChIP 20 vagy hasonló programokkal. A motívumkereséshez átfogó ismert és de novo eredetű motívum adatbázisra van szükség z. B. ENCODE motívumok 25 vagy a Hocomoco adatbázis 31. A Hocomoco egy adatbázis, amely motívumokat fedezett fel nyilvánosan hozzáférhető emberi és egér ChIP-Seq kísérletekből. Ha a feltételezett fehérje motívumai ismeretlenek, a de novo motívumkutatás új motívumként a csúcsok jelentős részében ismétlődő szekvencia mintákat tárhat fel. A transzkripciós faktorok kombinációs lehetőségei akkor mutathatók be, ha más transzkripciós faktorok motívumai is megtalálhatók, gazdagodva a kapott csúcsokkal.
A meggazdagodott csúcsrégiókat kísérletileg validálhatjuk, kontrollként a mutált vagy a knockout sejtek kromatinját használva. A transzkripciós faktort nem expresszáló sejtekkel végzett ChIP-Seq elvégzését hamis pozitív csúcsok azonosítására használják, amelyeket "fantomcsúcsoknak" is neveznek 32. A hamis pozitív eredményeket kiszűrjük.
Érdekes összehasonlítani a kapott ChIP-Seq csúcsokat a transzkripptikus adatokkal is. A PDGFRα-Olig2 ChIP-Seq csúcsokat összehasonlítottuk a gének OPC-kben való expressziójával egy korábbi publikációban 18. Ez a stratégia korlátozott lehet, mivel az OPC-ben expresszált géneket megkötő mechanizmusok szabályozhatók, mivel az Olig2 transzkripciós faktor szabályozható. Ezenkívül az Olig2 transzkripciós faktor képes megkötni egy génszabályozó régiót, de a gén alacsony génexpressziós szinttel rendelkezik a lehetséges gátló mechanizmusok vagy a génátíráshoz szükséges ko-faktorok hiánya miatt.
A ChIP-Seq egy módszer, amelyet a transzkripciós faktorok és más fehérjék genomszintű DNS-kötőhelyeinek azonosítására használnak. A transzkripciós faktorok egyidejű előfordulásának elemzésével azonban a kutatók azt találták, hogy a transzkripciós faktorok általában társulnak a Co 33-as modult alkotó más fehérjékkel. Ez azt jelenti, hogy a transzkripciós faktorok és a ChIP-Seq által feltárt genomi DNS közötti néhány kapcsolat közvetett, és más fehérjék áthidalják őket. Ezért az értelmesebb eredmények elérése érdekében a kutatóknak egyszerre több transzkripciós faktort kell tanulmányozniuk.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Közzétételek
A szerzők kijelentik, hogy nincsenek pénzügyi érdekkonfliktusaik.