Ateroszklerotikus plakkok kiváltása a mineralokortikoid receptorok aktiválásával
Összegzés
Leírunk egy protokollt az ateroszklerózis kiváltására az ApoE -/- egerek alortoszteron folyamatos felszabadításával aterogén étrendet tápláló egerek aorta gyökereiben. A plakk-összetétel jellemzésének módszereit is leírják.
Absztrakt
Bevezetés
Számos tanulmány kimutatta, hogy az aldoszteron részt vesz az érelmeszesedés kialakulásában 8, 9, 10. Az aldoszteron infúzió ApoE -/- atherogén étrenddel táplált egerekben felgyorsítja az ateroszklerotikus elváltozások kialakulását, ami aorta gyökér gyulladását és lipidekben gazdag plakkképződést idéz elő. .
Összefoglalva, leírunk egy protokollt, amely magában foglalja az aldoszteron infúziót, az aterogén étrend etetését, a szívszövet beágyazását, az ateroszklerotikus elváltozások mennyiségi meghatározását és jellemzését ApoE -/- egerekben. Ez az eljárás elősegíti a gyulladt, lipidekben gazdag ateroszklerotikus plakkok hatékony képződését, és értékes modellt nyújt az aterogenezis vizsgálatához.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
A tanulmányt az Olasz Országos Egészségügyi és Felhasználási Intézet bizottságai finanszírozták, engedélyszám: 493/2016-PR. Valamennyi eljárást az Európai Közösség laboratóriumi állatok felhasználására vonatkozó irányelvei szerint hajtották végre (EU 2010/63/UE irányelv).
Megjegyzés: Az ozmotikus minipumpa szubkután beültetése 8-10 hetes hím egerekben hordozóval (etanol sóoldatban) vagy aldoszteronnal (240 µg · kg -1 · d -1) 8-10 hetes hím egerekben nem megfelelő az ApoE gén számára. Általában a 8-10 hetes hím ApoE -/- egerek súlya körülbelül 25-26 g.
- Oldjon fel 5 mg aldoszteronport 1 ml abszolút etanolban.
- 68,3 µL fiziológiás sóoldat Hozzáadunk 56,7 µl aldoszteront (etanolban oldva), hogy 2,27 µg/µL koncentrációt kapjunk. töltse fel teljesen a teljes ozmotikus minipumpát 125 µL oldattal (az egyes minipumpák maximális kapacitása 125 µL).
- Minipumpa áramlási sebessége 0,11 µL/h; Ezért 2,64 µL oldat szabadul fel 24 óránként, és adjon minden egérnek körülbelül 6 µg · d -1 aldoszteront 28 napig.
(2) ozmotikus szivattyú feltöltése és beültetése
Megjegyzés: A szivattyúk két különálló részből állnak: a szivattyú fő részéből és az áramlásszabályozóból.
3. a szív boncolgatása
4. Vágjon szakaszokat az aorta gyökérből
MEGJEGYZÉS: A következő protokollokban leírt összes festési lépést Coplin üvegfestő küvettákban hajtják végre.
(6) Ateroszklerotikus elváltozások képelemzése aorta gyökérszakaszokban
Megjegyzés: Az olajvörös O-val vagy MAC3-tal vagy egy érdekes antitesttel festett aortagyökér-szakaszok megfelelő szoftverrel feldolgozhatók (információk Anyagtáblázat) elemezni kell. A vizsgált komponens pozitív pixelfestése pozitív a plakk teljes területére normalizálva. A képeket egy vak kezeléssel foglalkozó nyomozó gyűjtötte össze és elemezte.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
8-10 hét múlva Apo// - egereket vivőanyaggal vagy aldoszteronnal infúzió céljából beültetünk (1E. Ábra)-1I) és 4 hétig aterogén étrendet tápláltak (kalória-étrend 42% zsírtartalmú). A kezelés végén az egereket eutanizáltuk és PBS-sel perfundáltuk 10% formalinnal a fent leírtak szerint. Az aorta gyökér elvált a szív apikális részétől, és beágyazódott az OAT-ba (2. ábra). Az aorta gyökereinek keresztmetszetei különféle festésre készek voltak kriosztátgép segítségével (3. ábra).
Az ateroszklerotikus plakk-összetétel a plakk fejlődési szakaszát meghatározó egyes komponensek festésével jellemezhető. Olajvörös O festést alkalmaznak az érelmeszesedéses elváltozások zsírtartalmának meghatározásához az 5.1 lépésben leírtak szerint, Picro Sirius vörös festést használnak a kollagéntartalom meghatározásához az 5.2 lépésben leírtak szerint, a Mac3 festést pedig a lépésben leírt makrofágtartalom mérésére 5.3. Négy hetes aldoszteron egerekkel végzett kezelés után a lipid jelentősen megnőtt (4A. Ábra)-4 C) és a makrofágtartalom (4. ábra-4F) az ateroszklerotikus plakkokban az aorta gyökér szintjén jelenik meg, de a kollagéntartalomban nem észleltek különbségeket (4. ábra-4I) összehasonlítva a vivőanyaggal kezelt egerekkel. Ebben a modellben az aldoszteron felgyorsítja az aterogenezist, érgyulladást indukál, de nem fibrózist (4. ábra).
1. ábra: Oszmotikus minipumpa előkészítése és beültetése vivőanyaggal vagy aldoszteronnal. TÓL TŐL) Az ozmotikus mini szivattyúk járművel vagy aldoszteronnal történő megtöltésének lépései. C) Lépések a szivattyú testének az áramlásszabályozóval történő lezárására. D-F) Lépések a szivattyú beültetéséhez az egér hátulján. G-me) Oszmotikus minipumpa beültetése és a metszés varrása. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
2. ábra: Készüljön fel a szív és az aorta gyökér beágyazására és levágására. TÓL TŐL) a szív a jobb és a bal pitvar alsó pontjait összekötő egyenes mentén keresztirányban van elvágva. A szív apikális részét feldolgozzuk az aorta gyökér ateroszklerotikus elváltozásának mennyiségi meghatározásához. C) az aorta gyökere a szív belsejéből. D-E) A szívüreget okt. F) A szív orientációja egy OCT-vel előretöltött alakban (a szívüreggel az alak alja felé) G) A boncolt szív OCT-vel történő befagyasztása a formában. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
Az ateroszklerózis krónikus gyulladásos betegség, amely a nagy és közepes ereket érinti, és több sejttípus között kölcsönhatásban van, mint pl B. A makrofágok, a T-limfociták, az endothelsejtek és a simaizomsejtek az 1. sejtekhez vannak rendelve. Az egér atherogén modelljeinek korlátai ellenére sok bizonyíték áll rendelkezésre az érelmeszesedés folyamatáról. Ezeknek a modelleknek az az előnye, hogy gyorsan létrehoznak egy bizonyos korú és nemű kísérleti kohorszokat. Az egerek szintén meghatározott és homogén genetikai hátteret mutatnak.
Az érelmeszesedéses plakkok kialakulása, amelyet az arterioszklerózisra fogékony egérmodellekben figyeltek meg, részben emlékeztet az alanyokra, kivéve a megfigyelt instabil plakkok képződését 4. Az embernél a szívinfarktus fő okozója, a lepedékrepedés és az azt követő trombózis nem volt megfigyelhető egér atherogén modelljeiben. Publikációinkban megmutattuk, hogy az aldoszteron infúziója instabil plakkfenotípus indukálására 4 hét után HFD-10-et tápláló ApoE -/- egerekben. Valójában ez a kezelés növelheti az aorta gyökér plakk-, zsírtartalmát és gyulladásos területének szintjét, szignifikáns különbség nélkül, összehasonlítva a kezeletlen egerek 10 kollagéntartalmával. Megjegyzendő, hogy ezek az egerek fokozott hipertóniától független ateroszklerózis kialakulást mutatnak, mivel az aldoszteron-kezelés 10 vérnyomása nem változott jelentősen.
Jelen kéziratban részletesen bemutatjuk a szívszövet októberi beágyazásának technikai eljárását és az egymást követő lépéseket, azaz. H. Aorta gyökérvágás és plakk elemzés. A paraffinnal összehasonlítva az OCT lehetővé teszi a metszetek előkészítését nagy vastagságú tartományban (1-100 µm) kriosztát mikrotomával és minimális szöveti feldolgozással. A korlátozások befolyásolhatják a fagyott szövet minőségét is, ami potenciálisan befolyásolhatja a jégkristályok képződését, megváltoztathatja a szubcelluláris részleteket és immunhisztológiai festéssel detektálható műtermékeket hozhat létre. Valójában a krioprezerválásról úgy gondolják, hogy jobban megőrzi az antigént és az antigenicitást. Valójában a fagyott szövet megőrzi az antigének szerkezetét. Az immunhisztokémiai fagyasztott szövetek feldolgozása lehetővé teszi a formalin, amely mérgező és rákkeltő anyag, használatát is elkerülhető.
Megjegyzés A három szelep megjelenésekor a legjobb, ha a szövetet különböző vastagságúra vágja, az elvégzett elemzés típusától függően. Valójában néhány diát használnak a lepedék progressziójának meghatározására, míg a fennmaradó diák különböző foltokhoz használhatók (pl. Picro Sirius, Mac3 stb.).
Az aldoszteronnal kezelt egerek ateroszklerotikus elváltozásai lipidekben gazdagnak tűnnek, és a makrofágokra az olaj Red O (lipidfestéshez), Mac3 (makrofágfestéshez), Sirius vörös (kollagénfestéshez) vagy más érdekes specifikus antitestek alkalmazása jellemző. Fehérjék. Fontos kiemelni, hogy a TOT beágyazása, ellentétben a paraffin beágyazásával, elkerüli az elváltozások lipidtartalmát eltávolító szerves oldószerek alkalmazását. Ezért az OCT beágyazott szakaszain az olaj Red O-val történő lipidfestés megvalósítható, és az ateroszklerotikus plakkok zsírtartalma pontosan meghatározható.
Jelen kéziratban megmutattuk, hogy az aldoszteron infúzió értékes módszer az érelmeszesedés elősegítésére ApoE -/- egerekben. Szerint az aldoszteron infúzió ApoE -/- egerekben képes: 1) fokozni az endothelsejtek aktiválódását, amelyet a monociták tapadásában és vándorlásában szerepet játszó molekulák fokozott expressziója képvisel az érelmeszesedés plakkképződésének korai szakaszában 12, 13; és 2) lipid- és gyulladáscsökkentő makrofágtartalom az aorta gyökér 10., 13. szakaszának növelésére. Ezek a hatások nem az aldoszteron 10 hemodinamikai hatásainak köszönhetők. Összefoglalva, a javasolt protokoll érvényes módszert nyújt az érelmeszesedés előállítására és jellemzésére egerekben; Ez figyelemmel kísérheti a betegség korai szakaszait, valamint az érelmeszesedés terápiás beavatkozásának és rehabilitációjának eredményeit.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.