Az aktin citoszkeleton szabályozása hasnyálmirigy-acin sejtekben a tirozin-kináz segítségével Igen - PDF

Ulmi Egyetem Belgyógyászati Klinika I. vezető Prof. G. Adler Az aktin citoszkeleton szabályozása hasnyálmirigy-acinos sejtekben a tirozin-kináz által Igen Értekezés az emberi biológia doktori fokozatának megszerzéséről (Dr. biol. Hum.)

Megbízott dékán: Prof. Klotz 1. Riporter: PD Dr. Lutz 2. riporter: Dr. A doktori fokozat napja: 2002. december 20

Elkötelezettség szüleimnek, akik mindig támogatták az álmaimat

Tartalom 1 TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK. 1 RÖVIDÍTÉSEK. 3 1. BEVEZETÉS. 5 2. CÉL. 19 3. ANYAG ÉS MÓDSZEREK. 20 3.1. Anyag és állatok. 20 3.1.1. ELLENANYAG. 20 3.1.2. VEGYSZEREK. 21 3.1.3. ÁLLATOK. 21 3.2. Mód. 22 3.2.1. AZINI SZIGETELÉSE A PATKÁN PANCREÁTÓL. 22 3.2.2. AMILÁZISSZEKTÍRÓ VIZSGÁLATOK FRISSEN ELSZÁLÁLT AZ AZINI PATKÁNYBAN. 23 3.2.3. IMMUN fluoreszcens folt. 23 3.2.4. Fehérjekivonatok előállítása. 24 3.2.5. FEHÉRKONCENTRÁCIÓS MEGHATÁROZÁS. 25 3.2.6. SZUBCELLULÁRIS FRAKCIÓ. 26 3.2.7. IMMUNPECIPITÁCIÓ. 27 3.2.7. A fehérjék gélelektroforetikus elemzése SDS-OLDALON. 28 3.2.8. NYUGATI BLOTT. 29 3.2.9. A FEHÉRJE MEGFELTÉTELE ELLENI SZERVEKKEL. 29 3.2.10. INDIA INKING. 30 3.2.11. IGEN KINASE-TEVÉKENYSÉG. 31 3.2.12. AZ IMMUNOBLOTOK DENSITOMETRIAI ÉRTÉKELÉSE. 32 3.2.13. Az RNS izolálása AZINI-ból. 32 3.2.14. Az RNS tisztaságának és minőségének ellenőrzése. 32 3.2.15. A GÉN-RÖGZÍTÉSEK HIDRIDIZÁLÁSA. 34 4. EREDMÉNYEK. 37

Tartalomjegyzék 2 4.1. Szabályozás fehérje szinten. 37 4.1.1. Az SRC kinázainak fehérje expressziója. 37 4.1.2. A tirozin-foszforilálás IGEN-től a CCK-stimulációig. 38 4.1.3. IGEN MŰVÉSZETI TEVÉKENYSÉG. 41 4.1.4. AZ IGEN HELYI HELYEZÉSE ÉS ÁTOSZTÁSA. 44 4.1.5. KORRELÁCIÓ AZ AKTIN BONTÁS ÉS IGEN TEVÉKENYSÉG között. 46 4.1.6. TITKOLÁS AZ ELSZigetelt SZOLGÁLTATÁSBÓL. 49 4.1.7. IGEN-TÁRSAI FEHÉRJEI. 51 4.2. Gén expresszió. 53 4.2.1. Az RNS SZIGETELÉSÉNEK KONCENTRÁCIÓINAK VIZSGÁLATA. 54 4.2.2. A gén kifejezése a CCK-val való stimulálás után. 55 5. MEGBESZÉLÉS. 60 5.1. A fehérjék szabályozása. 60 5.2. Differenciális génexpresszió. 66 6. ÖSSZEFOGLALÓ. 69 7. IRODALOMJEGYZÉK. 71 FÜGGELÉK. 83.

Rövidítések 3 RÖVIDÍTÉSEK ábra ábra Víz kettős desztillált víz BSA szarvasmarha szérum Albumin CCK Kolecisztokinin CCK-R CCK Receptor ECM Extracellular Matrix et al és mások Exp Experiment FAK Focal Adhesion Kinase g gramm IB Immunoblot IF Immunofluorescence IgG Immunoglobulin G H + Immunecrecipció + Fény (az IgG mindkét lánca) HRP torma-peroxidáz (torma-peroxidáz) kda kilodalton kg kilogramm M moláris perc perc mk monoklonális ml milliliter µg mikrogramm N normál nm nanométer nm nanomoláris PBS foszfáttal pufferolt sóoldat PMSF fenilmetilén-szulfonil-fluorid pk poliklonális

Rövidítések 16 óra pikomoláris PVDF polivinilidén-difluorid Pyk2 prolinban gazdag tirozin-kináz 2 szobahőmérsékletű SDS nátrium-dodecil-szulfát SEM standard hiba SH Src homológia TBS Tris-pufferolt sóoldat Tyr tirozin pl. például

1. Bevezetés 12 Adherens junction (Ohkubo et al. 1999). A p120ctn nem vesz részt közvetlenül a fehérje-fehérje kölcsönhatásban az aktin filamentum rendszerrel, mivel nem tud kötődni az a-kateninhez. A zonula adherens fehérjék egyik lehetséges szabályozási mechanizmusa a tirozin-foszforiláció, mivel a β- és a γ-katenin, valamint a p120ctn növekedési faktorokkal történő stimulálással foszforilezhető tirozin (Hazan és mtsai 1998; Rosato és mtsai 1998). A P120ctn stabilizálja a sejt-sejt adhéziót az E-kadherinhez való kötődéssel (Yap és mtsai 1998); ezt gátolja a p120ctn hiperfoszforilációja mitózis során (Hazan és mtsai 1998). A cateninek tirozin-foszforilációja kulcsszerepet játszhat a zonula adherének stabilitásában vagy instabilitásában, és ezáltal az aktin filamentumrendszer lehorgonyzásában a plazmamembránnal (Behrens és mtsai 1993). Az izolált aciniben végzett vizsgálatokban a p120ctn foszforilációjának mértékében bekövetkezett változást is megfigyelték a szupramaximális szekréciós CCK-koncentrációval történő stimuláció után (Leser et al. 2000).

1. Bevezetés 14 A kérdéses FAK és paxillin. Mindhárom fehérjét más sejtrendszerekben az Src kinázok szubsztrátjaiként írták le (Calautti és mtsai 1998) (Schlaepfer és mtsai 1999; Shen és mtsai 2001). Az Src-kinázok családjába 9 fehérje tartozik, amelyek kifejezett szerkezeti homológiával rendelkeznek. Az Src család kinázainak többsége csak hematopoietikus sejtekben expresszálódik, ahol gyakran felesleges, amint azt a knock-out modellek is bemutatták (Smith és mtsai 2001). Másrészt az Src-kinázok Igen, Lyn, Fyn és Src mindenütt kifejeződnek, és úgy tűnik, hogy különböző szerepeket töltenek be (Thomas és mtsai 1995). Az Src kinázok kezdetben a citoplazmában lokalizálódnak, és aktív enzimekként szinte kizárólag a sejtmembránokhoz kötődnek. A szekvenciahomológiák alapján összesen hat, különböző feladatokkal rendelkező funkcionálisan releváns tartomány különböztethető meg (3. ábra). (Brown és mtsai 1996)

1. A hajtogatott fehérje 17. bevezetése és nem foszforilezhető (Gonfloni et al. 2000). Szubsztrátok kötése az SH2 doménhez szintén nehéz. Az Src-kinázok aktiválásának számos lehetősége van: A Tyr 527 defoszforilezése egy nagy affinitású szubsztrát foszfatáz-kompetitív kötésével az SH2 vagy SH3 doménhez, ezáltal a foszforilezett Tyr 527 kiszorítja az alloszterikus aktivátort vagy a fehérje módosítását (pl. Szerin/treonin foszforiláció), amely a zárt A konformáció destabilizálódott. A fehérje minden esetben kibontakozik, és lehetővé válik a kináz domén autofoszforilezése (4. ábra). Ez aktiválja a kinázt. A Csk-t negatív szabályozó fehérjeként írják le, amely felelős a Tyr 527 foszforilációjáért (Brown és mtsai 1996).

1. Bevezetés 18 PTyr 527 Tyr 527 inaktív aktív 4. ábra: Az Src kinázok aktivitásának szabályozása. Inaktív formában (balra) a fehérje erősen hajtogatott állapotban van. Aktív formában az SH3 domén elválik a prolinban gazdag spiráltól, és az SH2 domén már nem kötődik a farokrégióhoz (immár foszforilálatlan tirozin maradékkal). Az aktív oldal megköti az ATP-t (piros), amely készen tartja a foszfátcsoportot az aktiválásra. Az első reakció a tirozin maradék foszforilezése közvetlenül az ATP kötőhely mellett (autofoszforilezés). Amikor ez a tirozin foszforilálódik, az enzim maximálisan aktiválódik. (Godsell 2001 után)

3. Anyag és módszerek 20 3. ANYAG ÉS MÓDSZEREK 3.1. ANYAG ÉS ÁLLAT 3.1.1. Antitestek A következő táblázat (2. táblázat) bemutatja az összes felhasznált elsődleges antitestet/antiszérumot és azok forrásait. Megnevezés Faj Gyártó IB IP IF Igen Egér, mk Transduction 1: 5000 Pyk2 egér, mk Transduction 1: 1000 Pyk2 nyúl, Biomol, pk Hamburg Phosphotyrosine (PY20) egér, mk Transduction 1: 2500 Src egér, mk UBI 1: 200 Fyn nyúl, pk UBI 1: 500 Lyn Hase, pk Santa Cruz 1: 500 FAK egér, mk Transduction 1: 1000 P120ctn egér, mk Transduction 1: 1000 3 5 µg, 350 750 µg fehérjéhez 5 µg 750 µg fehérjéhez 5 µg 650 µg-hoz Protein 1: 1000 1: 200 2. táblázat: Elsődleges antitestek Az összes peroxidázzal párosított másodlagos antitestet Pierce-től kaptuk. Az immunfluoreszcens festéshez Alexa 488 kapcsolt szekunder antitesteket kaptunk a Molecular Probes (Eugene, USA) és Cy3 kapcsolt másodlagos antitesteket Dianova (Hamburg) cégtől.

3. Anyag és módszerek 21 3.1.2. Vegyszerek neve Aminosavak (nem esszenciálisak, MEM 100x) CCK-8, szulfatált (CCK 25-32) kollagenáz, (CLSPA) L-glutamin OregonGreen-Phalloidin szarvasmarha szérumalbumin (BSA) szója tripszin inhibitor inhibitor Life Technologies, Karlsruhe Bachem, Bubendorf, Svájc Worthington, Cell Systems, Hamburg Life Technologies, Karlsruhe Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA Fluka, Buchs Boehringer, Mannheim 3. táblázat: Anyagok Hacsak a szöveg másképp nem szerepel, az összes többi vegyi anyagot az 1. o. A. vagy ultra tiszta minőségű a Fluka (Buchs), a Merck (Frankfurt), a Roth (Karlsruhe) és a Sigma (Deisenhofen) gyártóktól. 3.1.3. Állatok A tesztállatok hím Wistar patkányok voltak a beltenyésztett WAG/RijCrl törzsből (Charles River, Sulzfeld). Az állatokat ketrecben legfeljebb 3 patkányon tartottuk kontrollált világos-sötét körülmények között, 12 óra sötét fázissal 19 óra és 7 óra között. A szobák légkondicionáltak voltak (21 C szobahőmérséklet, 55% páratartalom). Az állatokat az Altromin ad libitum tenyésztési és tartási étrenddel etették. A kísérletek során 100-200 g súlyú patkányokat használtunk, amelyeket egy éjszakán át éheztünk.

3. A 24 anyag és módszerek blokkolva vannak a PBS-ben. Az elsődleges antitesteket (PBS-ben) inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, vagy egy éjszakán át 4 ° C-on. A tárgylemezeket ezután háromszor PBS-sel mostuk. A szekunder fluorokrómhoz kapcsolt antitesttel vagy 0,2 µm Oregon Green konjugált falloidinnal történő inkubálást két órán át sötétben, szobahőmérsékleten folytattuk. A tárgylemezeket ezután háromszor mossuk, mielőtt az acinokat Mowiolba (Calbiochem, Bad Soden) ágyaznánk, és a tárgylemezekre alkalmazzuk. Az immunfluoreszcens foltok elemzését konfokális lézeres pásztázó mikroszkóppal (TCS 4D, Leica, Heidelberg) végeztük. 3.2.4. Fehérjekivonatok előállítása A problémától függően a következő lízispuffereket használtuk. Deoxikolát/Triton lízis puffer: Tris/HCl, pH 7,5 50 mm NaCl 150 mm EGTA 1 mm EDTA 0,4 mm Triton X-100 1% dezoxikolát 1% (tömeg/térfogat) Na ortovanadát 0,5 mm Na- Fluorid 5 mm szójabab tripszin inhibitor 1 mg/ml PMSF 1 mm aprotinin 1,4 µg/ml leupeptin 10 µg/ml Ezt a puffert a tirozin-foszforilált fehérjék elemzéséhez és a kináz aktivitás meghatározásához használták.

3. Anyag és módszerek 25 DTT/Triton X-100 lízispuffer (az Antibody Array, Biocat, Heidelberg szerint): Tris/HCl, pH 7,5 15 mm NaCl 120 mm KCl 25 mm EGTA 2 mm EDTA 2 mm DTT 0,1 mm Triton X-100 0,5% Na-ortovanadát 0,5 mm Na-fluorid 5 mm szójabab tripszin inhibitor 1 mg/ml PMSF 1 mm aprotinin 1,4 µg/ml leupeptin 10 µg/ml Ezt a puffert együtt immunprecipitációra használtuk az alkalmazott Yes-Pyk2 fehérjekomplexeket. A megfelelő stimulációkat jéghideg KRH puffer hozzáadásával leállítottuk, majd a sejteket 500 × g-os pelletekkel pelletáltuk. Ezután a felülúszót leszívjuk, és az acinit 200 400 μl lízispufferben szuszpendáljuk és ultrahanggal 5 másodpercig homogenizáljuk. Az ezt követő jégen történő inkubálás 30 percig tartott a fehérje-fehérje komplexek izolálásához és 10 perc az összes többi izoláláshoz. Az oldhatatlan anyagokat centrifugálással legalább 20 percig 10 000xg nyomáson 4 ° C-on ülepítjük. 3.2.5. Fehérjekoncentráció meghatározása Az extraktumok fehérjetartalmát módosított Bradford-módszerrel határoztuk meg BioRad Protein Assay (BioRad, München) és BSA kalibrációs vonal (0,7 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0, 1mg/ml).

3. Anyag és módszerek 28 3.2.7. A fehérjék gélelektroforetikus elemzése az alkalmazott SDS-PAGE pufferekkel (Lämmli 1970 szerint): 10 × SDS futópuffer Tris 25 mm glicin 191 mm SDS 10% (w/v) elválasztó gél puffer Tris, pH 8,8 1,5 M SDS 0,4 % Tris, ph 6,8 0,5 M SDS 0,4% 4 x SDS mintapuffer, Tris, ph 6,8 250 mm glicerin 40% SDS 10% 2-merkaptoetanol 20% bromofenol kék 1 mg A nem folyamatos SDS poliakrilamid gélelektroforézis módosított formában, Lämmli 1970 szerint. A Mini-Protean II (BioRad, München) szolgált elektroforézis készülékként. 20 μg lizátum összes fehérjét vagy az immunprecipitátok felülúszóját alkalmaztuk, amelyet előzőleg 4x SDS mintapufferrel kevertünk és hőnel denaturáltunk (5 perc, 95 ° C). Az elektroforézis állandó áramerősség mellett zajlott: 20 ma a gyűjtő gélben és 35 ma az elválasztó gélben.

3. A 32. anyagokat és módszereket, valamint a kináz reakciót 10 mm ATP-koncentráció mellett, 37 ° C-on 1 órán át hajtottuk végre. Minden további lépést az utasításoknak megfelelően dolgoztunk fel. Az abszorpciót 405 nm-en (referencia hullámhossz 620 nm) mértük. 3.2.12. Az immunblotok denzitometriai értékelése A sáverősségek denzitometriai összehasonlításához az exponált röntgenfilmeket átbocsátott fényszkenner (Sharp JX-330) segítségével szkenneltük és a Phoretix (New Castle upon Thyne, Nagy-Britannia) 1D szoftverével elemeztük. 3.2.13. RNS izolálása aciniból Az izolált acini stimulálását jéghideg RNS-mentes PBS-sel állítottuk le, 1000 fordulat/perc sebességgel 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszót eldobtuk. Az RNS-t a Promega protokoll szerint izoláltuk (SV Total RNS Isolation System, Promega, Mannheim). 3.2.14. Az RNS-koncentráció meghatározásának tisztaságának és minőségének ellenőrzése Az izolált RNS-t vízzel 1: 100 arányban hígítottuk, és az abszorpciót két különböző hullámhosszon mértük. Az RNS-koncentrációt a 260 nm-en mért abszorpció alapján számítottuk, és az izolált RNS tisztaságát a 260/280 nm arányból kaptuk. Koncentrációszámítás: 1 = 40 µg/ml abszorpció

3. Anyag és módszerek 34 kissé keverve. A mintákat betöltöttük a gélbe, és 50 V-on elválasztottuk 1-2 órán át. 3.2.15. A géntömbök hibridizálása A szűrők előhibridizációját 0,5% SDS-sel forraltuk, és a membránokat (GF300 - GeneFilters Rat Microarrays Release 1, Res Gen, Invitrogen) 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk minden előhibridizáció előtt. 90 μl lazac-spermium DNS-t (ssdna) 5 percig forralunk 95 ° C-on, és jégen rövid ideig lehűtjük. Az ssdna-t és 120 μl trna-t ezután hozzáadunk 12 ml előhibridizációs pufferhez. Az előhibridizációt több órán át 42 ° C-on hajtottuk végre a hibridizációs kemencében. Előhibridizációs puffer: formamid 50% SSC 6x Denhardt s 5x NaPO 4 50 mm SDS 0,5% reverz transzkriptáz reakció (RT) 25 μg RNS-t minden esetben 11 μl folyadékon bepároltunk a Speed Vac-ban. Az RT-hez az Ambion Strip-EZTM RT készletet (Ambion, Austin, TX) használtuk. 25 µg RNS/11 µl 2 Ml Oligo (dt) az Ambion-tól. Ezt az elegyet 65 ° C-on 5 percig forraljuk, majd 42 ° C-ra hűtjük. Ezután a következő került be:

3. Anyag és módszerek 35 2 μl 10x RT puffer 2 μl 10x dntp 1 μl MMLV RT (reverz transzkriptáz) 2 μl (= 20 μci) P 33 -α datp (Amersham) Az RT-t 37 ° C-on 1 2 órán át végeztük. . A cdna tisztítása Először RNSse H emésztést hajtottunk végre az RNS eltávolítása céljából. Ehhez 1 μl H RNSse-t adunk a mintához, és 30 percig inkubáljuk 37 ° C-on. A cdnát nukleotid-eltávolító készlet (Qiagen, Hilden) segítségével tisztítottuk. A tisztítás után a mintát 50 ul EDTA-val (50 mm) eluáltuk az oszlopokról. Az ismétlődő cdna-szekvenciák versengése Verseny-keverék: 50 µl 20x SSC 70 µl 10 mm Tris ph 8,0 45 µl Patkányhibrocita (1 mg/ml) (Applied Genetics Laboratories, Melbourne, Ausztrália) 20 µl 1% SDS és a megtisztított cdnát 5 percig külön-külön denaturáltuk 95 ° C-on, és jégen azonnal lehűtöttük. Ezután mindkét adagot egyesítettük, és 40 percig 56 ° C-on inkubáltuk. A kompetitív CDN-t friss prehibridizációs oldatba pipettáztuk, és hozzáadtuk a génszűrőkhöz. A hibridizációt legalább 18 órán át 42 ° C-on hajtottuk végre a hibridizációs kemencében.

3. Anyagok és módszerek 36 A szűrők mosása A mintát eldobtuk, és a szűrőket kétszer 5 percig mostuk 2x SSC-vel; 0,1% SDS szobahőmérsékleten mosva. Ezt két szigorúbb mosási lépés követte 68 ° C-on 0,2 × SSC-vel; 0,1% SDS 15 percig minden alkalommal. A géntömböket 2 réteg szűrőpapír közé helyeztük a maradék folyadék eltávolítása érdekében, és fóliába csomagoltuk. Foszforszűrőt (Kodak, Stuttgart) alkalmaztunk körülbelül 5 napig. A jelet foszforszkennerrel (Molecular Dynamics, Amersham Biosciences, Sunnyville, CA) pásztáztuk, és az Array Vision 6.0 szoftverrel értékeltük (Imaging Research).

4. Eredmények 37 4. EREDMÉNYEK 4.1. SZABÁLYOZÁS A FEHÉRJES SZINTEN 4.1.1. Az Src-kinázok fehérje-expressziója Az Src-kinázok fehérje-expressziós mintázatának vizsgálatához patkány acináris hasnyálmirigy-sejtjeiben 20 μg teljes fehérjét extraháltunk a patkány hasnyálmirigy izolált acinjából és elektroforézissel elválasztottuk. A fehérjét Western blot-ban vittük át a PVDF membránra, és megvizsgáltuk az Src család mindenütt expresszált kinázainak expresszióját. A kinázok elleni antitesteket Igen, Src, Lyn és Fyn ellen használtuk. Igen és Lyn a WAG patkány acináris hasnyálmirigy-sejtjeiben expresszálódik, míg Src és Fyn nem volt kimutatható (5. ábra). A kináz Src-hez kontrollt használunk (az A431 sejtvonal sejtlizátuma), mivel az Src-t acináris sejtekben írják le az irodalomban (Nozu és mtsai 1999). Patkányainkban azonban az Src kináz nem mutatható ki. IB: Igen Lyn Fyn Src 1 2 3 4 5 5. ábra: Az Src család kinázainak expressziója a WAG patkány acináris sejtjeiben. 1–4. Sáv: összes fehérje; 5. sáv: pozitív kontroll az Src esetében (sejtlizátum A431-től).