Az antigén-antitest reakciók párhuzamos többkomponensű elemzésének kidolgozása a

Az antigén-antitest reakciók párhuzamos többkomponensű elemzésének kidolgozása a doppingelemzésben Doktori értekezés a "doktor rerum naturalium" (Dr. rer. Nat.) Tudományos fokozat megszerzéséhez. A biokémia tudományos diszciplínájában Kai Wunderlich Potsdam, 2014. szeptember 29

Ezt a művet a Creative Commons licencszerződése alapján licencelték: Hozzárendelés Nincs kereskedelmi használat Nincs származtatott munka 4.0 Nemzetközi A licenc feltételeinek megtekintéséhez kövesse a következő hivatkozást: megjelent a Potsdami Egyetem publikációs szerverén: URN urn: nbn: de: kobv: 517-opus4-76869 http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76869

Az élet olyan, mint egy kerékpár. Előre kell lépnie, hogy ne veszítse el egyensúlyát. Albert Einstein

Tartalomjegyzék Táblázatok listája V VII ábrák listája 1. Motiváció 1 1.1. Dopping társadalmi és sportkörnyezetben. 1 1.2. Doppingtiltások és a doppingellenőrzés szükségessége 5 1.3. Lehetőségek és perspektívák a doppingellenőrzések során végzett ápolóhelyi vizsgálatokhoz. 7 2. Alapok 9 2.1. A dopping kifejezés és az anyagosztályok besorolása a WADA tiltott listájába. 9 2.2. Analitikai módszerek a doppinganyagok kimutatására. 12 2.2.1. Gázkromatográfia/tömegspektrometria, mint bevett analitikai módszer a doppingelemzéshez. 13 2.2.2. Immunvizsgálaton alapuló detektálási módszerek a peptid hormonok és növekedési faktorok kimutatására 15 2.2.3. Az antitestek működése és szerepük az immunvizsgálatokban. 16 2.3. Peptid hormonok jelöltként egy többparaméteres doppingteszt kifejlesztésére. 19 2.3.1. A luteinizáló hormon (LH) és szerepe doppingszerként. 20 2.3.2. Az emberi koriongonadotropin (hcg-i) és szerepe doppingszerként. 23 2.3.3. Ezen peptid hormonok változatai és farmakológiai határértékei. 24 2.4. Műszaki koncepció. 25 I.

4.3. Mikroszemcsés kísérletek a keresztreaktivitás meghatározására . 60 4.3.1. Microarray kísérletek különböző detektáló antitestek egyidejű alkalmazásával referencia anyagon. 63 4.4. Határozza meg a peptidhormonok mennyiségi meghatározásának határát a mikroszkópon. 67 4.4.1. A hcg-intakt koncentrációs sorozatai 1x PBS pufferben 67 4.4.2. A hcg-β koncentrációs sorai 1x PBS pufferben. 68 4.4.3. Az LH koncentrációs sorozatai 1x PBS pufferben. 69 4.5. Valódi minták mérése üveg- és polimer tárgylemezeken 70 4.6. Végezzen teljesítményelemzést a D-SN és a D-SP meghatározásához. 72 4.6.1. Az LH, a hcg-intakt és a hcg-β diagnosztikai érzékenységének és specificitásának meghatározása. 72 4.7. A mikro-sugarak tárolási stabilitási vizsgálata a mérési eredmények tekintetében. 77 4.7.1. Tárolási stabilitási teszt tizenkét héten keresztül a hcg-intakt kimutatására. 77 4.7.2. Tárolási stabilitási teszt tizenkét héten keresztül a hcg-β kimutatására. 79 4.7.3. Tárolási stabilitási teszt tizenkét héten keresztül az LH kimutatására. 80 5. Megbeszélés 83 6. Kitekintés 93 7. Összefoglalás 95 Bibliográfia 99 A. 111. melléklet A.1. Pufferek és megoldások. 111 A.1.1. SDS gélösszetétel a gél szétválasztására és összegyűjtésére 113 A.2. Táblázatok. 114 A.3. Publikációk. 126 A.3.1. Szakmai értékelésű publikációk. 126.

A.3.2. Előadások, poszterek és nem szakértői véleményezésű kiadványok. 127 A.4. Önéletrajz. 128 A.5. Hálaadás. 129 A.6. Törvényes nyilatkozat. 130

A táblázatok listája 3.1.1. Felhasznált eszközök. 29 3.1.2 Felhasznált fogyóeszközök. 30 3.1.3 Felhasznált vegyszerek és oldatok. 31 3.1.4 Antitestek. 32 3.1.5 Peptid hormonok és a minta anyaga. 33 3.1.6 Felhasznált szoftver. 34 3.2.1 Gélbetöltési SDS-PAGE. 36 3.2.2 Western blot teszt beállítása. 37 3.2.3 Kísérleti séma, keresztreaktivitás mikroszkóppal. 42 3.2.4 A mérési eredmények osztályozása igazságmátrix segítségével 48 3.2.5 A minta mérete a reprodukálhatóság meghatározásához tizenkét hét alatt. 51 4.1.1. A monoklonális befogó antitestek keresztreaktivitási vizsgálata. 56 4.1.2. A poliklonális detektáló antitestek keresztreaktivitási vizsgálata. 57 4.2.1.Mosott oldatok összehasonlítása feldolgozott mikrorayákon. 60 4.3.1. Keresztreaktivitási teszt hcg-i-vel a kimutatási mikro-sugarakon és a szekunder antitestek 1x PBS-ben. 61 4.3.2 A mátrixhatások és a keresztreaktivitás meghatározása komplex mintákban. 65 4.5.1. Valódi minták mérése üveg- és polimer tárgylemezeken 71 4.6.1. 130 szérum minta teljesítményelemzésének ROC görbéi 73 4.6.2. A 130 minta analitikus értelmezése egyvakos megközelítésből. 75 4.6.3 A kölni Biokémiai Intézet mintakollektívájának értékelése. 76 4.7.1 A hcg-i mikrorakatai tárolási stabilitási vizsgálata tizenkét hét alatt. 78 v

4.7.2. A hcg-β mikrorakatai tárolási stabilitási vizsgálata 12 hét alatt. 80 4.7.3 A mikrorakók stabilitási vizsgálata az LH esetében tizenkét hét alatt 81 A1. Mintakulcs a 130 szérummintához a teljesítményelemzéshez. 114 A2. Keresztreaktivitási teszt a kimutatás és a szekunder antitestek mikrorayájain, különböző hcg-i koncentrációkban, 1x PBS-ben. 118 A3. Keresztreaktivitási teszt a kimutatás és a szekunder antitestek mikrorayájain, különböző hcg-i koncentrációkban, referenciaanyagban. 119 A4. Keresztreaktivitási teszt a kimutatási és a referenciaanyag szekunder antitestjeinek mikro-sugarain. 120 A5. Mátrixhatások és keresztreaktivitás meghatározása komplex mintákban. 121 A6. A kölni Biokémiai Intézet mintakollektívájának értékelése. 122 A7. A hcg-i mikrorangjai stabilitásának tesztje tizenkét hét alatt123 A8. A hcg-β mikro-sugarainak stabilitási tesztje tizenkét hét alatt. 124 A9. A mikrorakók stabilitási vizsgálata az LH esetében tizenkét hét alatt 125

A 2.1. Ábrák felsorolása. A WADA 2013-ban tiltott anyagok listája 11 2.2. Doppingminták elemzése. 13 2.3. Munkafolyamat-diagram. 27 3.1. A mikro-sugarak foltmintázata. 40 4.1. SDS-PAGE a fehérjekoncentráció ellenőrzésére. 54 4.2. A mikrorajz kereszt-reaktivitási vizsgálatának összefoglalása GLYMO-val módosított üveglemezeken. 66 4.3. Az emberi koriongonadotropin hcg koncentrációs sorozatai 1x PBS-ben. 67 4.4. A hcg-β koncentrációs sorai 1x PBS pufferben. 68 4.5. Az LH koncentrációs sorozatai 1x PBS pufferben. 69 4.6. Az LH koncentrációja teljes szérumban. 70 VII

2.1. A dopping kifejezés és az anyagosztályok besorolása a WADA tiltott listájába 2.1. Ábra: A WADA tiltott anyagok listája 2013 (rövidítve). Az itt felsorolt anyagosztályok (és példák) a versenyeken és azokon kívül bármikor tilosak. Az S 2.2 pontban (piros doboz) felsorolt peptidhormonok: a koriongonadotropin (CG) és a luteinizáló hormon (LH) csak férfiaknál tilosak, mivel szabályozó hatással vannak a tesztoszteron kaszkádra. Mindkét hormont vizeletből határozzuk meg immunvizsgálatokkal. [WADA, 2012] 11

3. Anyagi és kísérleti munka, valamint 14 000 U/mg bioaktivitás. Ez a törzsoldatban 14 000 mu/µl bioaktivitásnak felel meg. A hcg β-alegysége törzsoldatként áll rendelkezésre, 0,1 mg/ml koncentrációban. A gyártó erre vonatkozóan semmilyen bioaktivitást nem közöl. [Stenman és mtsai, 2006] szerint a hcg-β bioaktivitása 1 U/µg. Ennek megfelelően a hcg-β törzsoldata 100 U/ml vagy 100 mu/µl-t tartalmaz. Az LH 0,1 mg/ml koncentrációban volt jelen. 3.2.3. Táblázat: Vizsgálati séma a tesztkomponensek lehetséges keresztreakciójának kimutatására. Mintamátrixként a standard szérumot/vért és a kontroll szérumot/vért is ugyanazon séma szerint teszteltük, az 1 x PBS pufferhez hasonlóan. A keresztek a peptid hormonok és a detektáló antitestek kombinációit jelentik. hcg-α hcg-β LH CRP - poliklonális detektáló antitestek - - - - x - - - - - x - - - - x - - - - x - - - - x - - - 100 mu/ml LH - x - - - - x - - - - x - - - - x - - - 500 mu/ml hcg - x - - - - x - - - - x - - - - x - - - 36 mu/ml hcg-β - x - - - - x - - - - x 42