Az egereknél végzett anyai fenilketonuria-szindróma-vizsgálatok egy lehetséges megközelítést javasolnak
- alanyok
- absztrakt
- háttér
- Mód
- Eredmények
- Következtetés
- Fő
- Mód
- A feljegyzések retrospektív klinikai áttekintése
- Állatok, gondozás és eljárások
- PEGilezett rekombináns Phe ammónia-liáz
- Phe assay
- Aminosav elemzés
- Farmakodinamikai modellezés
- Eredmények
- Anyai PKU: A Floridai Egyetem Orvostudományi Főiskolai tapasztalata
- Pegvaliase és a PKU egér
- vita
- További információ
- Word dokumentumok
- További információ
- Kiegészítő módszerek
- Kiegészítő ábra S1
- Kiegészítő ábra S2
- Kiegészítő S1 táblázat
- Excel fájlok
- Kiegészítő táblázatok
alanyok
- Biológiai terápia
- Endokrin rendszer és anyagcsere-betegségek
- Gyermekgyógyászati kutatás
- A terhesség lefolyása
absztrakt
háttér
A kezeletlen fenilketonuria (PKU), amely az emberek egyik leggyakoribb genetikai betegsége, általában értelmi fogyatékossághoz vezet. Bár a fehérjealapú mesterséges táplálkozás megakadályozhatja a késést, a felnőtteknél az étrend betartása gyakran gyenge. Terhes PKU-nőknél a be nem tartás anyai PKU-szindrómához vezethet, amelyben a magas fenilalanin (Phe) szint súlyos magzati szövődményeket okoz. A Phe ammónia-liázzal (PAL) végzett enzimhelyettesítő terápia korrigálja a PKU-t a mutáns BTBR Phe hidroxiláz egerekben (Pah enu2), javasolva az anyai PKU-szindróma lehetséges kezelését emberben.
Mód
Áttekintettük a klinikai adatokat, hogy értékeljük az anyai PKU-szindróma előfordulását terhes PKU-nőknél. Női PKU egereket (normál étrenden) PAL-val kezeltünk, fiziológiai szinten stabilizáltuk a Phe-t, és pároztuk őket a terhesség kimenetelének értékeléséhez.
Eredmények
Az orvosi feljegyzések azt mutatják, hogy az étrend hatékonysága az anyai PKU-szindróma megelőzésében sajnos nem javult jelentősen a probléma 40 évvel ezelőtti megjelenése óta. A terhes PKU egerek PAL kezelése azt mutatja, hogy a PAL kezelt anyák utódai felnőtt korukig túlélik, szemben a kezeletlen egereknél megfigyelt teljes letalitással vagy a PKU diétán csökkent egerek túlélési arányával.
Következtetés
A PAL kezelés csökkentette az anyai PKU szindróma súlyosságát egerekben, és hatással lehet az emberi PKU terápiára.
A rosszul kontrollált PKU-val rendelkező anyák fejlődő magzatát hátrányosan befolyásolhatja a megemelkedett Phe-szint méhen belüli expozíciója. Az anyai fenilketonuria-ról szóló együttműködési tanulmány megállapította, hogy az anyai vérben az emelkedett Phe-szint teratogén (5, 6, 7, 8, 9). Az anyai PKU-szindrómában szenvedő gyermekek mikrocefáliában, craniofacialis diszmorfizmusban, alacsony születési súlyban, veleszületett szívbetegségekben, fejlődési késésekben és értelmi fogyatékosságban szenvednek (10, 11, 12). 1980-ban az 524 terhességű anyák 95% -ánál 155 nőnél a vér Phe-koncentrációja ≥ 1200 μM volt legalább egy értelmi fogyatékos gyermek (13). Az értelmi fogyatékosság, a mikrocefália és a veleszületett szívbetegségek előfordulása sokkal gyakoribb volt, mint az általános populációban, és korrelált az anya vérében a Phe-koncentrációval.
A PKU egér az emberi PKU bevett modellje, és hasonló klinikai jellemzőkkel rendelkezik, mint a PKU betegeknél, beleértve a hyperphenylalanemia-t (a kiindulási plazma Phe-koncentrációja 1000–2000 μM), a hipopigmentációt, a kognitív rendellenességeket, az audiogén rohamokat és az anyai PKU-szindrómát. (21, 22). . Korábbi vizsgálatokban a pegvaliase egyszeri, szubkután beadása 80 mg/kg dózisban hím PKU egereknek legfeljebb 1200 μM-rel csökkentette a Phe plazmaszintjét enu2 hordozó egerekben (HET) és homozigóta BTBR-ben 10 hónapon keresztül. - A Pahenu2 mutáns (PKU) egerek (21) a Jackson Laboratories-ból (Bar Harbor, ME) származnak. Valamennyi protokollt a Floridai Egyetem IACUC hagyta jóvá. Az egereket visszatartották a pegvaliase kezeléshez, és a pegvaliase-t subcutan injektálták a hát felső és alsó nyaki régiójába. A Phe plazmát 45-ből nyertük. 1 heparinizált mikrokapilláris csőben összegyűjtött vérminta.
PEGilezett rekombináns Phe ammónia-liáz
Az Anabaena variabilis pegvaliase PEGilezett, rekombináns formáját a BioMarin Pharmaceutical (Novato, Kalifornia) biztosította. 10 mg/ml steril oldat (
12 NE/ml) pegvaliase-t hetente 5 mg/ml-re hígítottunk és 0 ° C-on tároltunk. A kívánt dózistól függően az alikvotákat 0,5–2,0 mg/ml-re hígítottuk, és 10 μl/g testtömegre injektáltuk őket.
Phe assay
A Phe-plazmát fluorometriai vizsgálattal (24) határoztuk meg, amelyet alaposan módosítottak kis mennyiségek, gyors átfutási idők és mikrotiterlemez formátum esetén. A vérminták plazmáját a vizsgálatig lefagyasztották. Minden plazmaminta alikvot részét (7,5 µl) felszabadítottuk a fehérjékből, 96 lyukú PCR-lemezre helyeztük, vizsgálati koktéllal, és 2 órán át inkubáltuk 60 ° C-on. Rézreagenseket adtunk egy 0,5 ml-es 96 lyukú fekete fluoriméterlemez (Nunc, Roskilde, Dánia, kritikus a pontos plazma Phe meghatározáshoz) mindegyik lyukába, és hozzáadtuk az inkubált plazmamintákat. A lemez egy SpectraMax M2 lemezolvasón (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) volt gerjesztési paraméterekkel: 378 nm; Kibocsátás: 512 nm.
Aminosav elemzés
Egyetlen aminosavakat és standardokat (Sigma), valamint nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás reagenseket (Fisher) a Sigma Chemicaltól (St. Louis, MO) és a Fisher Scientific-től (Atlanta, GA) szereztünk be. A plazmamintákat fehérjéből eltávolítottuk, és belső standardként norleucint adtunk hozzá. A szárított mintákat fenil-tiokarbamil-származékkal derivatizáltuk, vákuumban szárítottuk, a reagens feleslegét eltávolítottuk, és Beckman System Gold LC-vel kromatografáltuk UV-VIS detektorral (254 nm) és egy Phenomenex reverz fázisú C18 analitikai oszloppal. Az aminosav-koncentrációkat a standard/belső standard csúcsterületek felhasználásával számítottuk a minta csúcsterületeihez viszonyítva.
Farmakodinamikai modellezés
A farmakokinetikai paramétereket egyszeri dózisú farmakokinetikai/farmakodinamikai vizsgálatokból határozták meg (Musson és Laipis, az adatokat nem közölték) naiv egereken. A plazmaminták pegvaliase szintjét a BioMarin Pharmaceutical segítségével elemeztük pegvaliase-specifikus szendvics enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal. A kötött pegvaliasist anti-PEG antitesttel detektáltuk. A mennyiségi meghatározás határa 60 ng/ml volt, a plazma Phe-szinteket a fent leírtak szerint határoztuk meg. A plazma Phe plazmakoncentrációit különböző pegvaliase adagolási ütemterveknél WinNonlin 5.2-es verzióval (Certara, Princeton, NJ, USA) modelleztük.
Eredmények
Anyai PKU: A Floridai Egyetem Orvostudományi Főiskolai tapasztalata
A Floridai Egyetem Orvostudományi Főiskolája Gyermekgyógyászati Klinika, Klinikai Genetikai és Metabolizmus Tanszék Észak-Florida régióját szolgálja Pensacolától Jacksonville-ig Orlandóig. Ez egy egyetemi orvosi központ, amely a környékbeli PKU-betegek többségét rendellenességük miatt kezeli. A terhes PKU-nők prenatális tanácsadásban és intenzív táplálkozási terápiában részesülnek a magzatot fenyegető kockázatok miatt. Noha a központ távolsága sok beteg számára kényelmetlenné teszi a betegeket, folyamatosan tájékoztatják őket az étrendről, és felkérik őket, hogy heti rendszerességgel nyújtsák be a vér Phe értékeit és a testsúlyát. Javaslataink terhes (és valószínűleg terhes) PKU-nők számára, hogy a vér Phe-szintjét 120 és 240 μM és Tyr között tartsák 50 μM felett, tartsák be a terhességre ajánlott tápanyag-bevitelt és elősegítsék a megfelelő súlygyarapodást.
Retrospektíven megvizsgáltuk 28 terhesség rekordját 1996 és 2010 között. A betegeket három csoportra osztották:
1. csoport: Kiváló Phe-kontroll (3/28) - Az átlagos vér Phe-értékek a terhesség alatt 360 μM alatt voltak, a maximális értékek bármely időpontban 420 μM Phe alatt voltak, és az első trimeszterben legalább hat Phe-értéket regisztráltak.
2. csoport: Borderline Phe Control (11/28) - az átlagos vér Phe-szint 420 µ alatt volt az első trimeszterben M, majd a második és a harmadik trimeszterben átlagosan 360 µ alatt. M. Azok a betegek, akiknek az első trimeszterében a kezdeti plazma Phe értéke 700 μM vagy kevesebb, a terhesség fennmaradó részében pedig két vagy kevesebb 500 μM feletti érték volt.
3. csoport: Nem megfelelő Phe-kontroll (14/28) - az átlagos Phe-plazmaszint 420 μM fölött volt az első trimeszterben, a terhesség fennmaradó részében 360 μM feletti átlagokkal és/vagy 420 μM feletti többszörös értékekkel.
Az átlagos Phe-értékeket a terhesség 40 hetében a három betegcsoport esetében az online kiegészítő S1 ábra mutatja. Az S1 kiegészítő táblázat összefoglalja az egyes terhességek normálisnak vagy érintettnek minősített eredményét a születési paraméterek (súly, magasság, fej kerülete), a rendelkezésre álló klinikai vizsgálati adatok és az anyai PKU-szindrómához kapcsolódó állapotok alapján. A csoportok között egyértelmű különbségek vannak (abszolút Phe-érték, elért kontrollszint, az egyes időintervallumok alatt rögzített maximális Phe-értékek és terhességi eredmények); Az egyes csoportok részletes leírása megtalálható a "Kiegészítő klinikai eredmények" fájlban.
Pegvaliase és a PKU egér
A pegvaliase terápiás előnyeinek értékelése a terhes PKU nők és az anyai PKU kockázatának kitett magzatainak kezelésében különböző dózisok és kezelési sémák segítségével megvizsgáltuk annak hatását az anyai PKU szindrómára női PKU egerekben. Vizsgálataink eredményeit az 1. táblázat foglalja össze; Az egyes vizsgálatok részletes eredményeit az S2 kiegészítő táblázat tartalmazza. Itt megjegyezzük, hogy az anyai PKU szindróma szignifikánsan súlyosabb a PKU egérben, mint az emberi PKU betegeknél. Az újszülött teljes halála az élet első 24 órájában a szokásos eredmény (21). Ezenkívül bár a Phe-korlátozott étrend részben korrigálhatja az anyai PKU-szindrómát PKU egerekben, kevés kölyökkutya éli túl az alacsony Phe-diétával való elválasztást (21).
50 g, és a táplálékfelvétel ennek több mint a duplája lesz. A táplálékfelvétel a születés után visszatér a normális szintre, de a szoptatás során ismét növekszik, mivel az ápoló anya 40-50 g kölyökkutyát etet 14 nappal a születés után, amikor a kölykök szilárd ételeket próbálnak kipróbálni. Ezek a tényezők azt jelezték, hogy a felnőtt, nem vemhes egereknél alkalmazott heti kétszeri adagolási rend nem tudta megfelelően fenntartani a fiziológiai plazma Phe-szintet.
Kezdetben azt gyanítottuk, hogy az anyai plazma Phe-szintje a 08-005 vizsgálatban olyan alacsony értékeket és túl magas értékeket érhetett el, amelyek túl alacsonyak és túl magasak voltak a kölykök túléléséhez, mint például a Phe korlátozott étrend tanulmány és a rövid pegvaliase vizsgálat. Felezési idő (21, 23). Ennek megfelelően nyolc nőstény PKU egeret (08-027. Vizsgálat) kezeltünk egymás után farmakodinamikai modellezéssel kifejlesztett pegvaliase protokollokkal, hogy az átlagos plazma Phe-szint 250 µg legyen. M 4 µ-nél M (1. táblázat és S2 kiegészítő táblázat). Bár a végső protokoll (hétfő, szerda, 10 mg/kg; péntek, 20 mg/kg) kiváló fizikai állapotot és megnövekedett élettartamot eredményezett, az alom nagysága és az élő kölykök száma csak kismértékben nőtt (az átlagos alom 6-os méret (2 alom) 10 kölyök születéskor); A terhes elválasztott kölyökkutyák 32% -a). Ezek a nőstények a párzás idején szignifikánsan idősebbek voltak a kívánt 4-PM plazma Phe-szint eléréséhez szükséges protokoll-kiigazítások miatt (1. táblázat).
Egy harmadik vizsgálatban (09-068a) 12 nőstény PKU egeret kezeltek kissé eltérő adagolási renddel (10 mg/kg pegvaliase, hétfő, reggel 8:00; szerda, péntek, 16:00), ahol a farmakodinamikai modellezés szintén egyenletes plazmát eredményezett A Phe-nek biztosítania kell az ellenőrzést (1. ábra és 1. táblázat). Ezenkívül a plazma mintákat 16 óra helyett reggel 8 órakor vették. Ez a 12 PKU egér átlagosan 300 ug volt. M Phe szint 4 µ-nál M, ami a Phe-szint jó kontrollját jelzi a héten, ahogy azt a farmakodinamikai modellezés előre jelzi. A 8-AM vérminták értékei azonban drámaian megnőttek (1. ábra). Ezeket a nőket az adagolási protokoll alatt pározták, és összesen 39 terhességük volt (1. táblázat, S2 kiegészítő táblázat). Ezeknek a terhességeknek csaknem több mint 50% -a elválasztott kölyökkutya, átlagos alom nagysága körülbelül hat kölyökkutya (öt alom nyolc vagy annál több kölyökkutyával), ami jobb, mint a korábbi eredmények.
A plazma fenilalanin (Phe) szintjének napi változása pegvaliase-kezelt fenilketonuria (PKU) egerekben. Tizenkét nőstény PKU egeret (09-068a vizsgálat) szubkután 10 mg/kg pegvaliase-t injektáltunk hetente háromszor (hétfő, 8:00; szerda 16:00; péntek, 16:00; ↓). Ennek az adagolási tervnek a farmakodinamikai modellezése (▪▪▪▪) jósolta a Phe plazmaszintjének jó szabályozását. Vérmintákat (40 ul) vettünk 8:00 és 16:00 órakor a hét különböző napjain, 7 héten keresztül, és a plazmaphe-szinteket átlagoltuk, hogy egy heti összetett plazmaphe-szintű diagramot (O) kapjunk. Az x tengely állványának fő hash jelei a hét napjaira (12:00 pm), a másodlagos hash jelek pedig 8:00 és 16:00 órára. A kezeletlen nőstény PKU egerek (2, •) összesített adatait hétszer megismételtük, hogy maximális egyezést mutassunk a pegvaliase-kezelés heti plazma Phe-adataival. A plazma Phe-csúcsok olyan időpontban fordulnak elő a kezelt állatoknál, amelyek megfelelnek a kezeletlen PKU egerek maximális plazma Phe-szintjének, bár a pegvaliase beadását követő napokon a 8-AM plazma Phe-értékének jelentős csökkenése Dózis figyelhető meg.
A plazma fenilalanin (Phe) szintjének napi változása kezeletlen nőstény fenilketonuria (PKU) egerekben. A 24 órás sötét-fény ciklus során bekövetkezett változást a plazma Phe-szintben az összetett adatok elemzéséből határoztuk meg. Vérmintákat (40 μl) vettek hat felnőtt nőstény PKU egérből a jelzett időpontokban, a mintákat 9 héten keresztül vették a vérveszteség miatti stressz elkerülése érdekében. Minden állatból két mintát vettek minden időpontban. A plazma Phe eredményeket egyesítettük és átlagoltuk, így kaptuk a 24 órás összesített adatrekordot. A grafikon mutatja a plazma Phe gyors, több mint 1000 μM-os növekedését, amely akkor következett be, amikor az egerek 18 órakor felébredtek és elkezdték az etetést, valamint a fényciklus kezdetétől reggel 6-kor lassabban csökken.
Egy másik tényező befolyásolhatja az anyai PKU szindróma pegvaliase kezelését. Kezeletlen emberi PKU-ban a Tyr és a Phe aránya gyakran csökken, a megfigyelt Tyr plazmaszintek a normál kontrolloknál megfigyelt értékek 50% -ára csökkennek (25). Nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával mértük a Trp, Tyr és Phe szintet WT, PKU és pegvaliase kezelt PKU egerekben (4. ábra). Csakúgy, mint humán PKU betegeknél, a PKU egerek plazma Tyr szintje a normális szinttől csökkent a Trp szint változása nélkül. A PKU plazma Phe szintjének fiziológiai vagy szubfiziológiai szintre történő csökkentése a pegvaliase révén nem volt hatással a plazma Tyr-re. A pegvaliase-kezelt PKU egér Tyr szintjének növelésére tett kísérletek Tyr hozzáadásával az ivóvízhez sikertelenek voltak, mivel rossz oldhatósága miatt. Ezért hozzáadott Tyr tartalmú mesterséges étrend alkalmazása (ahol az alacsony oldhatóság nem korlátozza a potenciális felvételt) szükséges annak meghatározásához, hogy az alacsony Tyr milyen szerepet játszhat az anyai PKU szindróma részleges válaszában a PKU egérben.
Aromás aminosavszintek vad típusú (WT) és fenilketonuria (PKU) nőstény egerek plazmájában. Kezeletlen WT és PKU egerekből és pegvaliase-kezelt PKU egerekből nyert plazmamintákat nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) elválasztással elemeztük. A kezeletlen PKU egerek plazmamintái szignifikánsan megemelkedett fenilalanin plazmaszintet és 40-50% -kal alacsonyabb tirozin plazmaszintet mutatnak a WT egerekhez képest. A triptofán plazmaszintje hasonló maradt a két genotípus között. A pegvaliase-kezelés a plazma Phe-t fiziológiai szintre vagy a normál fiziológiai érték alá csökkentette az adagolási rendtől függően. A tirozin és a triptofán szintje kezeletlen és pegvaliase-kezelt PKU egerekben hasonló volt.