Az élelmiszer-összetevők és azok hatása az autoimmun cukorbetegség patogenezisére emberekben és
1 TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Táplálkozási élettani elnök A háztartás- és táplálkozástudományok doktora Elnök: A disszertáció vizsgáztatója: egyetemi-prof. Dr. J. J. Hauner 1. Univ.-Prof. Dr. H. Daniel 2. apl. Prof. Dr. A-G. Ziegler A disszertációt a Müncheni Műszaki Egyetemen nyújtották be és a Weihenstephan Táplálkozási, Területhasználati és Környezetvédelmi Tudományos Központ elfogadta.
2 Két nagyapámnak
3 Tartalom-jegyzék Tartalom-jegyzék 1 Feladat Bevezetés és szakirodalmi áttekintés Az 1-es típusú cukorbetegség alapjai A genetika jelentősége Az 1-es típusú cukorbetegség patogenezise és immunológiai háttere Búza és fehérjefrakciói A lisztérzékenység, valamint az 1-es típusú cukorbetegség és a lisztérzékenység összefüggése A búzafehérjék hatása az autoimmun cukorbetegség kialakulására állatmodellekben 1-es típusú cukorbetegség Étrendi tényezők hatása az autoimmun cukorbetegség kialakulására a tehéntej és fehérjefrakcióinak állatmodelljében A tehéntejfehérjék hatása az autoimmun cukorbetegség kialakulására állatmodellben A búza és a tehéntej hatása az 1-es típusú cukorbetegségben A bélrendszerrel összefüggő immunrendszer és az autoimmun cukorbetegség közötti asszociáció További élelmiszer-összetevők és lehetséges potenciálja Összefüggés az 1-es típusú cukorbetegséggel Anyag és módszerek Vizsgálatok a NOD egérmodellen Egerek csoportja Diéták Protokoll Részleges 1. és 1.a kísérlet Protokoll Részleges kísérlet Protokoll Részleges kísérlet ÉN.
4 Tartalom 3.2 Kísérleti módszerek Gabonakivonat fehérjefrakciók előállításához Fehérjekivonatok előállítása élelmiszerekből vagy takarmányokból Fehérjefrakciók elektroforetikus szétválasztása (SDS-oldal) Kivonatok fehérjetartalmának meghatározása IgG inzulin autoantitest mérések egér és humán szérumokban Radioligand kötési vizsgálat élelmiszer-összetevőkkel IAA affinitás csirke inzulin IgA inzulin autoantitest mérések humán szérumokban Statisztikai eredmények Etetési kísérletek NOD egerekkel A NOD egerek táplálékfogyasztása és testsúlyának alakulása a kísérleti csoportokban 1. részkísérlet Búza és kazeintartalmú takarmány az alapdiétához képest Az NOD egerek kumulatív diabétesz kockázata az inzulin autoantitest prevalencia részkísérletében NOD egerek tíz hetes korban részkísérletben A cukorbetegség előfordulása NOD egerekben 25 élet hét előtt és után részleges kísérletben 2. részkísérlet Búza és búza komponensek mennyiségi meghatározása A kivont búzafrakciók fejlődése és minősége A NOD egerek kumulatív diabétesz kockázata a parciális tesztben A NOD egerek inzulin autoantitest prevalenciája tízhetes korban a II. részvizsgálatban
6 Tartalom 5.1 Etetési kísérletek NOD egerekkel Különböző fehérjeforrások hatása a cukorbetegség kialakulására a NOD modellben A lépcsőzetes búza-kiegészítők és az egyes búzafehérje-frakciók hatása a cukorbetegség kialakulására a NOD-modellben A kisgyermekek étrendjének egyéb élelmiszer-összetevőinek hatása a cukorbetegség kialakulására a NOD-modellben -A humán inzulin autoantitestek reakcióképessége csirke inzulinnal és IgA izotípus mérés Az inzulin autoantitestek viselkedése a csirke inzulinhoz humán szérumokban Az IgA inzulin autoantitest izotípusok azonosítása humán szérumokban Az inzulin autoantitest antitesthez kötődő autoantitestek kötő tulajdonságainak és izotípusainak tesztjeinek vizsgálata Az inzulin autoantitestnek az egyes fehérjékhez való kötődésének vizsgálata emberi szérumokban található élelmiszer-összetevőkkel Tehéntej-frakciók A keresztreaktív inzulin autoantitestek tesztjeinek végleges mérlegelése A jövő kilátásai Összefoglalás és következtetések IV. Irodalom
7 Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék. Ábrák felsorolása. Asztalok listája. Rövidítések listája. I-V VI-VIII IX-X XI Korábbi publikációk. XII önéletrajz. XIII-XIV hálaadás. XV V
10 Az ábrák felsorolása 26. ábra Az IAA kötése a tejhez, tejfehérjékhez, tápszerekhez és búzához az emberi inzulinhoz képest 27. ábra Az IAA kötési görbéi az élelmiszer-alkotórészekhez 75 28. ábra Az IAA kötési görbéi tejfehérjékhez 29. ábra Az IAA kötése különféle tejfehérjékhez Inzulin (1. rész) 30. ábra Az IAA kötése különböző tejfehérjékhez az inzulinhoz képest (2. rész) 31. ábra Az IAA kötése különböző tejfehérjékhez az inzulinhoz képest (3. rész) VIII
12 Táblázatok felsorolása 20. táblázat Az extrahált élelmiszer-oldatok különböző hígítású fehérjekoncentrációjának és az eredményül kapott átlagértékek elemzése 21. táblázat Azon vizsgálati személyek jellemzői, akiknek IAA tejpor-kivonathoz kötődik
13 Rövidítések listája Rövidítések listája Ábra. AK antitest aszparagin cpm radioaktív bomlás percenként (percenkénti szám) GAD (A) (glutamát dekarboxiláz HLA hisztokompatibilitási komplex (humán leukocita antigén) I (A) IA-2 (auto) antitest IA-2 ( A) (antitestek) fehérje tirozin-foszfatáz IA-2 ICA szigetsejt antitestek Ig immunglobulin MHC fő hisztokomabilitási komplex min. Perc nb nem ismert NOD nonobese diabéteszes RBA radioligand kötési vizsgálat fordulat/perc fordulat percenként T1D 1 típusú cukorbetegség Tab. TBST Tris pufferolt sóoldat plusz Tween TBT Tris pufferelt Tween t-tg szövet-tranglutamináz vs. 8 XI
16 feladat, amelyek az IAA lehetséges kezdeti célantigénjeként kérdésessé válhatnak. Összességében ennek a munkának ki kell dolgoznia az egyes élelmiszer-összetevők lehetséges hatását az autoimmun cukorbetegség immunfolyamatára. Az in vivo NOD-modellen kapott adatok felhasználásával a potenciálisan diabetogén élelmiszer-összetevőket humán szérumokkal tesztelik. Ezeknek az in vitro modelleknek a felhasználásával megvizsgálják, hogy az 1-es típusú cukorbetegség immunrendszeri eseményei eredetileg kiválthatók-e az élelmiszer-összetevőkkel való keresztreakciókkal. E kísérletek eredményei leírhatnák a cukorbetegség patogenezisének további, eddig ismeretlen mechanizmusait, és így felhasználhatók az elsődleges terápiák kifejlesztésére az 1-es típusú cukorbetegség kialakulásának megelőzésére a korai gyermekkorban. 3
Anyagok és módszerek (D diéta), egy második csoport maradt a búzát tartalmazó A étrenden, egy harmadik csoport pedig a búzamentes étrenden. A gluténmentes és kazeinmentes C diéta tenyészcsoportjának nőstény kölykeit egy három hétig tartó tesztcsoportba soroltuk 9 nőivarú állat, akik a C diétán maradtak (lásd 4. ábra). Tenyészpárok Gluténmentes, kazeintartalmú étrend B Glutén- és kazeinmentes étrend C Tesztcsoportok Diéta B n = 12 étrend A n = 12 étrend D n = 12 étrend C n = 9 4. ábra. 1. A B gluténmentes étrend tenyészcsoportjának hím fiatal állatait laktáció után három hetes korban elválasztottuk a gátaktól, a nőstény állatoknál leírtak szerint, és három tesztcsoportra osztottuk. A nőstény egerek csoportos eloszlásához hasonlóan az egyik csoport megkapta a referencia étrendet (D diéta), egy másik a búzát tartalmazó A étrendet kapta és egy harmadik csoport a B búza nélküli étrenden maradt (lásd 4a. Ábra). Tenyészpárok gluténmentes, kazeintartalmú étrend B Tesztcsoportok Diéta B n = 11 Diéta A n = 10 Diéta D n = 12 4a. Ábra A hím NOD egerek allokációja a tenyész- és tesztcsoportokhoz az 1a. Alkísérletben. 28.
Anyag és módszerek A búza fehérjefrakcióinak egymástól való elválasztása érdekében módosított háromlépcsős extrakciót hajtottunk végre, amelynek során az extrakció első lépésében az albuminok és a globulinok jelen voltak a felülúszóban, a második extrakciós lépésben a prolaminok (gliadinek) a felülúszóban és Az utolsó lépésben a glutenineket elválasztották (Wilson és Goulding 1991, Mimouni és mtsai 1998, Nicolas és mtsai Idris és mtsai 2003). Lisztalbuminek és globulinok extrakciós centrifugálása> 2x üledék Gliadine extrakciós centrifugálás> 3x gluteline üledék extrakció (N 2 atmoszféra) Centrifugálás> Az összes felülúszó 2x centrifugálása Csapadéktárolás 18 ° C-on 7. ábra A fehérje extrakciójának és a frakciók búzalisztből történő elválasztásának sémája. 0,1 g kereskedelemben kapható 550 típusú búzalisztet lemérünk, 1 ml Sörensen-puffert (pH 7,35) adunk hozzá, és az elegyet 4 ° C-on 20 percig rázzuk. 4 ° C-on végzett centrifugálás (20 perc, 1000 fordulat/perc, Sorvall RC 5B Superspeed Centrifuga) után a felülúszót eltávolítottuk, és az üledéket ugyanazzal a módszerrel extraháltuk, miután Sorensen puffert adtunk hozzá. A két felülúszót egyesítettük és 4 ° C-on tároltuk a további extrakciós lépések befejezéséig. 33
60 eredmény A NOD egereknek az ivóvízzel együtt beadott albuminek és globulinok mennyiségének meghatározása. Az extrakciós módszer igazolásához a búzaliszt fő fehérjéit frakcionáltuk, és az elválasztás tisztaságát gélelektroforézissel ellenőriztük (3.2.3. Anyag és módszerek). Standard albuminok és globulinok Glutenins Gliadins 10. ábra A búzafehérje-frakciók elektroforetikus elválasztása 12% -os poliakrilamid gélen. Az egyes fehérjefrakciókat a megfelelő sávokhoz rendeltük, és a molekulatömeg kda-ban a bal oldalon látható. Ezenkívül az extrakció hatékonyságát kvantitatív fehérje-meghatározással határoztuk meg BCA Protein Assay Kit segítségével (lásd 16. táblázat és 3.2.4. Anyag és módszer), és az extrakcióhoz a kívánt albumin és globulin frakció körülbelül 50% -os hozamát alkalmaztuk. helyezett. 47