Az endothel progenitor sejtek szerepe axiális spondyloarthropathiás betegeknél - PDF
1 A Göttingeni Egyetem Orvostudományi Karának Nefrológiai és Reumatológiai Klinikájáról (Prof. Dr. med. GA Müller) Az endoteliális progenitor sejtek szerepe axiális spondyloarthropathiás betegeknél INAUGURALIS ÉRTEKEZÉS a Georg August University Egyetem Orvosi Karának doktori fokozatának megszerzéséhez zu Göttingen, Maria Elisabeth Vogt, született Struve, Frankfurt an der Oder Göttingen, 2018
2 dékán: Prof. Dr. rer. nat. H. K. Kroemer Előadó: társelnök: harmadik felszólaló: Priv.-Doz. Dr. med. Susann Patschan Prof. Dr. med. Rotraut Mößner Prof. Dr. med. Margarete Schöm A szóbeli vizsga időpontja: 2019. június 12
3 Ezennel kijelentem, hogy elkészítettem az Endothel progenitor sejtek szerepe axiális spondyloarthropathiás betegeknél című disszertációt, és hogy az általam megjelölteken kívül nem használtam semmilyen forrást vagy segédeszközt. Osnabrück, a.
4 Az ábrák listájának tartalma. VI Táblázatok. VII A rövidítések listája. VIII 1. Bevezetés és célkitűzések Bevezetés Spondyloarthritis és axiális spondyloarthropathia Definíció és kórtörténet Epidemiológia/kórlefolyás Patogenezis Klinika és tanfolyam Diagnosztika Fizikai vizsgálat Eredmények Osztályozási kritériumok Képalkotó laboratórium Az AS ateroszklerózisának/kardiovaszkuláris kockázatának kezelése/kezelése axilláris endothelialis vasculogenesisben endnie és angiogogenis áttekintés Kísérleti leírás; EPC-k és különféle citokinek izolálása és tenyésztése További stimulánsok és gátló tényezők az EPC-számra vonatkozóan EPC-k a patológiás állapotok összefüggésében
5 3.4 A betegek kollektív eredményeinek statisztikai értékelése A CFU Hill assay eredményei FACS elemzés Vasomodulációs mediátorok Tanfolyam Beszélgetés Összefoglalás Függelék Irodalomjegyzék V
7 Táblázatok felsorolása 1. táblázat: A felhasznált fogyóeszközök felsorolása 38 2. táblázat: Az alkalmazott eszközök/eszközök összefoglalása 39 3. táblázat: A felhasznált reagensek felsorolása 39 4. táblázat: A betegcsoport alapvető jellemzőinek leíró statisztikái 46 5. táblázat: Klinikai mérések a gerinc mobilitásának/a betegség lefolyásának értékelésére 46 6. táblázat: A CFU-EC-k leíró statisztikája a betegcsoportban és a kontrollcsoportban 47 7. táblázat: A CFU-EC-k p-értékeinek felsorolása, különféle változók/jellemzők szerint osztályozva 48 8. táblázat: A szám leíró statisztikája nemek szerint osztályozott CFU-EC-k száma 49 9. táblázat: A CFU-EC-k számának leíró statisztikája, az ASDAS 52 VII szerint osztályozva
8 Rövidítések listája acldl = acetilált kis sűrűségű lipoprotein ankylosis = teljes ízületi merevítés AS = ankylopoetica spondylitis = spondylitis ankylopoetica ASAS = SpondyloArthritis International Society értékelése ASDAS = Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score axspa = Bathing Spondylarthropropathy Spondylis Ankylositis Funkcionális index BASG = Bath Ankylosing Spondylitis Global Score BASMI = Bath Ankylosing Spondylitis Metrology Index BSA = szarvasmarha szérum albumin BSG = ülepedési sebesség CAC = keringő angiogén sejt CD = differenciálódási klaszter CEC = keringő endothel sejt, keringő endothel sejtek CFU = gyulladásos bélbetegség alkotó egység CFU-EC = kolóniát alkotó egység endoteliális sejt CPC = keringő progenitor sejt CRP = C-reaktív fehérje DMARD = betegséget módosító reumaellenes gyógyszer ECFC = endotheliális kolónia képző sejt ELISA = enzimhez kapcsolt immunszorbens nt Assay Enthesitis = gyulladás az ín, az ínszalag vagy a kapszula csatlakozásainak területén EC = endothel sejtek ecfc = késői kinövések EPC EPC = endothel progenitor sejt VIII
9 ESSG = European Spondyloarthropathy Study Group FACS = fluoreszcenciával aktivált sejtválogatás FBA = ujj-padló távolság FLK-1 = VEGF receptor-2 CD309 KDR HDL = nagy sűrűségű lipoprotein HLA = humán leukocita antigén HSC = hematopoietikus őssejt IL-6 = Interleukin-6 KDR = kináz inzert doménreceptor CHD = szívkoszorúér-betegség LDL = alacsony sűrűségű lipoprotein LWS = ágyéki gerinc MC = mieloid őssejt MRT = mágneses rezonancia képalkotás NO = nitrogén-oxid NSAID = nem szteroid gyulladáscsökkentők nr-axspa = nem foszfát-artográfiai-axialphospialis-artialis-artialis-artialis-artialis-artialis-artialis-artialis-articalis sóoldat PDGF = vérlemezkéből származó növekedési faktor PPI = protonpumpa-gátlók RA = reumás ízületi gyulladás SDF-1 = sztrómasejtből származó 1a faktor SpA = spondyloarthritis, spondyloarthropathia, spondyloarthropathia TGF = transzformáló növekedési faktor TPC = szöveti rezidens progenitor sejt IX VEGF = vaszkuláris endothel növekedési faktor IX
11 A következő kérdéseket vizsgálták: 1. Milyen szerepet játszanak az EPC-k az axiális spondyloarthropathiában? 2. Változott-e számuk vagy funkcionalitásuk az egészséges kontroll csoporthoz képest? 3. Összefügg-e az EPC-k száma vagy funkciója a klinikai lefolyás súlyosságával, az alkalmazott gyógyszeres terápiával vagy a betegség aktivitásával? 4. Az EPC-k szerepet játszanak-e a betegség progressziójában az egyes betegeknél? Reméljük, hogy tanulmányunk eredménye hatással lehet a terápiás lehetőségekre vagy a prognosztikai paraméterekre. 2
19 A coxitis mellett egy francia tanulmány szerint jelentősen kedvezőtlen prognosztikai tényezők az ESR> 30, a nem szteroid gyulladáscsökkentők kezelésére adott rossz válasz, az ágyéki gerinc korlátozott mobilitása, a betegség korai (17 éves kora előtt) megjelenése, szervi megnyilvánulások vagy oligoarthritis (Puchner 2012). A nikotinfogyasztás és az elhanyagolás, vagy csak alkalmanként végzett fizioterápia szintén negatívan befolyásolja a tanfolyamot. A mortalitás különösen magas a megnövekedett kardiovaszkuláris kockázat miatt (Manger és Schulze-Koops 2012). 10.
24 TNF-α blokkoló okozza a teljes remissziót az axiális spondyloarthropathiában szenvedő betegek több mint 50% -ában (Barkham et al. 2009). Minden haladásmérés (BASDAI, BASFI, BASMI) javult 24 és 102 hét után, és a gyulladás paraméterei normalizálódtak (Braun és Sieper 2007). Haroon et al. (2013) szerint a TNF-α blokkolókkal végzett terápia, különösen, ha a betegség korai szakaszában kezdődik, csökkenti a radiográfiai fejlődést. A műtéti terápia csak a kiválasztott, fogyatékkal élő, például labilis gerincű betegek számára lehetséges. A farmakológiai terápia mellett alapvető szerepet játszik a nem gyógyszeres intézkedések, különösen a fizioterápia. Tanulmányok azt mutatják, hogy ha a testgyakorlatot rendszeresen végezzük, a fizikai funkció, a fájdalom és az általános jólét javulása bizonyítható (Dagfinrud et al. 2008). 15-én
48 anyag Eszköz CO2 inkubátor (fűtőszekrény) Eppendorf pipetta FACS-Calibur fagyasztó hűtőszekrény Mikroszkóp: Átfordított, fordított sejtkultúrás mikroszkóp Olympus IX-81 steril pad Tiszta levegő típusú CA/R Vortex Genie 2 centrifuga: Megafuge 1.0R centrifuga: Rotixa/A gyártó Sanyo Eppendorf AG, Hamburg Becton Dickinson Sanyo Liebherr Leica Microsystems Olympus Biohazard Bodo Schmidt GmbH Heraeus instruments GmbH Hettich 2. táblázat: Az alkalmazott műszerek/eszközök összefoglalása Anyag Gyártói katalógusszám Biocoll 1,0777 g/ml Biochrom AG, Belin L6115 BSA ph 7.0 LabClinics SA K Dil AcLD Molecular Prob L3484 Endocult Basal Medium StemCell Technologies Inc Endocult Supplement StemCell Technologies Inc FcR blokkoló reagens Millenyi Biotec Fibronectin FLK = egér-ember elleni kutatás-fejlesztési rendszerek, Minneapolis FAB 357F VEGFR2 Formalin-hidroklorid-lektin az Ulex europaeMIC1-1GG9-ALG9-ALG9-ALG9-ALG9-ALG9 PE antitestek Jackson Immunoresearch, Baltimore, USA 3. táblázat: Az alkalmazott reagensek listája 39
50 Ujj-padló távolság (FBA) A beteg egyenes lábbal, amennyire csak tud, előre hajlik. Megmérik a középső ujjhegy és a padló közötti távolságot. Ezt a mért értéket használják a gerinc, valamint a csípőízületek és az ischiocruralis izmok értékelésére. Gyakran használják a klinikán az előrehaladás nyomon követésére (Feldtkeller és van der Heijde 2005). A gerinc oldalirányú dőlése A páciens függőleges helyzetben méri a padló és a test középső ujjhegye közötti távolságot. Új mérést végeznek maximális oldalirányú dőlésszöggel, a lábak még mindig egyenesek (nincs forgás!). Az átlagértéket az első és a második érték különbségéből képezzük, mindkét oldalra mérve (norm> 10 cm), és a BASMI kiszámításához használjuk (van der Heijde et al. 2008). 10. ábra: A gerinc oldalirányú hajlásának sematikus ábrázolása (a mérés részleteit lásd a szövegben) Bokatávolság Ezt az intézkedést a csípőízület mobilitásának felmérésére használják. Amikor a beteg fekszik, a belső bokák közötti távolságot a lehető legszélesebb lábakkal mérjük (nyújtott térd, lábujjak felfelé) (norma> 100 cm). Ezt az értéket a BASMI tartalmazza (Feldtkeller és van der Heijde 2005). 41
51 Tragus-fal távolság Ez a mérés a kyphosis felmérésére szolgál. A tragus és a fal közötti távolságot úgy kell mérni, hogy a beteg egyenesen áll, háttal és sarokkal a falnak támasztva, és ez szintén a BASMI része (Feldtkeller és van der Heijde 2005). 11. ábra: A tragus-fal távolságának sematikus ábrázolása (a mérés részleteivel kapcsolatban olvassa el a szöveget) A nyaki gerinc forgása A beteg függőlegesen ülve és egyenesen előre tekintve a fejet jobbra és balra forgatja, amennyire csak lehetséges (standard > 70). A maximális forgatás és a nulla pozíció közötti szöget használják a BASMI kiszámításához. A vállat nem szabad megfordítani (Feldtkeller és van der Heijde 2005). BASMI A fürdő ankylopoetikus spondylitis metrológiai indexe különféle klinikai mérésekből áll a gerinc mobilitásának és az esetleges korlátozásoknak a felmérésére. Ide tartozik a módosított Schober-mérték, az ágyéki gerinc oldalirányú dőlése, a boka maximális távolsága, a tragus-fal távolsága, a nyaki gerinc forgása (a számítást lásd a függelékben). Ezt az indexet az angliai Bath városában vezették be 1994-ben. 42-ben
54 3.4 Statisztikai értékelés Az eredményeket a statsoft STATISTICA programjával értékeltük. Először az adatokat a normális eloszlás szempontjából Shapiro-Wilks-W teszttel teszteltük. A Statistica ennek a tesztnek a kiterjesztését használja, amelyet Royston 1992 írt le. Az összegyűjtött adatokban nincs normális eloszlás. Ezenkívül a leíró statisztikákat, különös tekintettel az átlagra és a szórásra, a STATISTICA segítségével készítettük. Mivel nincs normális eloszlás, nem statisztikai módszereket alkalmaztunk a statisztikai szignifikancia tesztelésére. Ehhez a Mann-Whitney U tesztet használták. A normál eloszlású normál t-próbával ellentétben ez nem az átlagértékeken, hanem a rangokon alapul. Jelentős különbséget, vagyis túl véletlenszerű asszociációt határoztak meg, amelynek p értéke 0,05 szignifikancia szint alatt volt. A különféle változók közötti kapcsolatok szemléltetésére a korrelációs együtthatót Spearman R-jével számítottuk, valamint a szignifikancia szintjét. Az eredmények szemléltetésére dobozos és szórási ábrákat hoztak létre. 44.
64 CFU-EC és a dohányzás A dohányzókban a CFU-EC alacsonyabb száma irányul. A nemdohányzókkal szembeni különbség azonban statisztikailag nem szignifikáns (p = 0,37). 70 Box-Whisker-Plot CFU és nikotin fogyasztás CFU átlagérték + SD: nikotin fogyasztás nincs nikotin fogyasztás nikotin fogyasztás nincs nikotin fogyasztás átlagérték átlag ± stdf. Átlagos érték ± 1,96 * stdf. Kiugró szélsőértékek 18. ábra: CFU-EC-k száma, nikotinfogyasztás szerint osztályozva 55
65 4.3 FACS-elemzés A cepcs kvantitatív értékeléséhez a betegmintákat FACS-eszközzel készítettük és elemeztük. A CD133 és az FLK kettős pozitív sejtjei megfelelnek a cepcs-eknek. Az egészséges kontroll csoporthoz képest itt nem látható szignifikáns különbség. Az átlag és a medián majdnem azonos (p = 0,69, N beteg = 49, N kontrollcsoport = 10). Nem volt statisztikailag szignifikáns összefüggés a mért CFU-EPC-k és az FACS által mért CD133 +/FLK + sejtek között. 8 Box-whisker diagram kettős pozitív CD133/FLK sejtes betegek és kontrollcsoport esetén Stdf. Átlagos érték ± 1,96 * stdf. Outlier extrém értékek 19. ábra: cepcs (% -ban) betegeknél és kontrollcsoportnál. 56
66 FACS és a betegség aktivitása A cepcsek megbetegedése a betegség aktivitása szerint, a BASDAI által mérve statisztikailag jelentéktelen tendenciát mutatott a magas betegségaktivitású cepcsek nagyobb számához (megfelel a BASDAI> 4; p = 0,1). FACS és nem A FACS által mért cepcsek nem szerinti osztályozása nem mutatott szignifikáns különbséget (p = 0,08). Férfi betegeknél alacsonyabb a cepcsek száma. 2,4 2,2 2,0 2,0 1,8 1,6 Box-Whisker-Plot Az EPC-k száma (% -ban) nemek szerint lebontva EPC 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 Átlag + SD: A nők 1,45 + 2,3 férfiak 0,62 + 0,8 0,4 nők a férfiak átlag ± stdf. Átlagos érték ± 1,96 * stdf. 20. ábra: cepcs (% -ban) nem szerint 4.4 Vasomodulációs mediátorok A különbözõ vazomodulációs mediátorok (VEGF, PDGF, TGF-β, angiopoietin -1 és -2) koncentrációi közötti különbségek a kontrollcsoportban és a betegeknél nem voltak statisztikailag szignifikánsak. 57