Az Escherichia coli molekuláris és funkcionális gyógyszerek probiotikus gyógyszereként
Escherichia coli, mint probiotikus hatóanyag gyógyszerekben .1980 Drezdában, benyújtva 2012. április 27-én
Tartalom TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK. RÖVIDÍTÉSEK FELSOROLÁSA. E AZ ÁBRÁK LISTÁJA. H TÁBLÁZATOK MUTATÓJA. J 1 BEVEZETÉS. 1 1.1 Az emberi bél mikroflóra. 1 1.1.1 A bélflóra összetétele és működése. 1 1.1.2 Az Escherichia coli szerepe. 3 1.2 A bélflóra rendellenességei és betegségei. 4 1.3 Probiotikumok. 6 1.3.1 Definíció, követelmények, példák. 6 1.3.2 Hatások és mechanizmusok. 7 1.3.3 Alkalmazási területek. 9 1.3.4 Mutaflor és Escherichia coli Nissle 1917. 10 1.3.5 Probiotikumok a SymbioPharm-tól. 10 1.3.5.1 A SymbioPharm termékei. 10 1.3.5.2 Symbioflor 2 - összetétele és hatóanyagai. 11 1.4 E. coli genomszekvenálása. 12 1.5 Prokarióták antimikrobiális peptidjei. 13 1.5.1 A bakteriocinek meghatározása és osztályozása. 13 1.5.2 Mikrozin. 15 1.5.3 Alkalmazási területek - jelen és jövő. 18 1.6 Feladat és cél. 20 2 ANYAG ÉS MÓDSZEREK. 21 2.1 Anyagok. 21 2.1.1 Felhasznált vegyszerek és fogyóeszközök. 21 2.1.2 Használt készletek. 21 2.1.3 Pufferek és törzsoldatok. 21 2.1.4 Tenyésztő táptalaj baktériumok szaporításához. 22 2.1.5 Antibiotikumok. 23 2.1.6 Sejtkultúra-kiegészítők. 23 A
Tartalomjegyzék 2.1.7 Baktériumtörzsek. 24 2.1.8 Plazmák. 25 2.1.9 Oligonukleotidok. 26 2.1.10 Enzimek. 27 2.1.11 Szoftver. 27 2.2 Módszerek. 28 2.2.1 Prokarióta sejtek tenyésztése. 28 2.2.1.1 Baktériumok tenyésztése. 28 2.2.1.2 Állattenyésztés. 28 2.2.1.3 Növekedési görbék. 28 2.2.2 Eukarióta sejtek tenyésztése. 29 2.2.2.1 Sejtkultúra. 29 2.2.2.2 Fagyasztás és felolvasztás. 29 2.2.3 Ko-tenyésztési kísérletek prokarióta és eukarióta sejtekkel. 29 2.2.3.1 Tapadásvizsgálat. 29 2.2.3.2. Invasion Assay. 31 2.2.3.3 Konfokális mikroszkópia. 32 2.2.3.4 Elektronmikroszkópia. 32 2.2.3.5. Inhibíciós bírósági teszt. 33 2.2.4 Molekuláris biológiai módszerek. 33 2.2.4.1. Polimeráz láncreakció (PCR). 33 2.2.4.2 Rövid DNS-szakaszok szekvenálása. 35 2.2.4.3 Agaróz gél elektroforézis. 36 2.2.4.4 DNS-tisztítás. 36 2.2.4.4.1 DNS-fragmensek tisztítása. 36 2.2.4.4.2 Tisztítás gél extrakcióval. 37 2.2.4.4.3. Szekvenálási reakciók tisztítása. 37 2.2.4.4.4 Alkoholos csapadék. 37 2.2.4.5 DNS-koncentráció meghatározása. 38 2.2.4.5.1 Abszorpció mérése. 38 2.2.4.5.2 A koncentráció meghatározása agaróz gélben. 38 2.2.4.6. Restrikciós endonukleázok alkalmazása. 38 2.2.4.7 Defoszforilezés. 39 2.2.4.8 Ligálás. 39 2.2.4.9 Kompetens cellák előállítása. 39 2.2.4.10 Elektroporáció. 40 2.2.4.11 Konjugáció. 40 B
Tartalomjegyzék 3.2.3.3 Escherichia coli G3/10 - Antimikrobiális peptid kimutatása. 86 3.2.4 A Mikrozin S kimutatása Escherichia coli G3/10-ben. 89 3.2.4.1. A Mikrozin S-t kódoló operon elemzése 89 3.2.4.2 Mikrozin-immunitás 90. o. 92 3.2.4.4. A mikrozin baktericid hatásának kimutatása 92. oldal 3.2.4.5 Gátlási zóna teszt. 94 3.2.4.6. Coinfekciós kísérletek enterohaemorrhagiás E. colival. 95 3.2.4.7 A fehérje szerkezetének és osztályozásának elemzése. 99 4 MEGBESZÉLÉS. 103 4.1 Symbioflor 2 E. coli - genomelemzés és probiotikumok. 103 4.1.1 A Symbioflor 2 E. coli genomok. 104 4.1.2 A Symbioflor 2. probiotikus hatása. 105 4.1.3 A Symbioflor 2. biztonságossága. 106 4.1.4 Az Escherichia coli G3/10 és az Escherichia coli Nissle 1917 összehasonlítása. 111 4.3 A mikrozin lehetséges felhasználása 113. o. 4.3.1 Az élelmiszeripar. 113 4.3.2 Mikrozin S - új antibiotikum. 115 4.3.3 EHEC - alkalmazási példa. 116 5 ÖSSZEFOGLALÓ/ÖSSZEFOGLALÓ. 119 5.1 Összefoglalás. 119 5.2 Összefoglalás. 120 6 IRODALOM. 123 7 FÜGGELÉK. 140 PUBLIKÁCIÓK. 172 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS. 174 D
Rövidítések listája SAP SD SDS Singleton-Gen Sm sp. ssp. ST STEC stx SUE T a TBE TE Tet TNF trna U UE UPEC UV V VTEC ZKBS ZO Garnéla alkalikus foszfatáz szórás Nátrium-dodecil-szulfát gén, amely egy genomra specifikus Események felhalmozódási hőmérséklete Tris-Borate-EDTA Tris-EDTA Tetraciklin Tumor Nekrózis Faktor Transzfer Ribonukleinsav Egységek Mellékhatás Uropatogén E. coli Ultraibolya Volt Verotoxint termelő E. coli Biobiztonsági Központi Bizottság Zonula occludens G
Az ábrák felsorolása 3.31. Ábra: A mikrozin H47 gén szkrínelése különböző EHEC törzsekben. 99 3.32. Ábra: A Mikrozin S prekurzor fehérje aminosavszekvenciája. 99 3.33. Ábra: A IIa osztályú mikrozinek prekurzor fehérjéinek aminosavszekvenciáinak összehasonlítása. 4.1. Ábra: Szekvencia összehasonlítás az E. coli G1/2 és az E. coli CFT073 hlycabd operonjának promóter régiójában. 108 4.2. Ábra: Az EcN (A) és az E. coli G3/10 (B) szerkezeti komponensei. 110 7.1. Ábra: Az McsA (A) és az McsB (B) fehérjék BLASTp elemzése. 164 I.
Bevezetés 1.5.2 Mikrozin A mikrozin kifejezést 1976-ban vezették be (Asensio és Perez-Diaz, 1976), hogy riboszomálisan szintetizált antimikrobiális peptideket jelöljenek alacsony molekulatömeggel, 5 kda-val. A peptid gerincét semmilyen módosításnak nem vetjük alá. A lineáris polipeptidek C-terminális szideroforral rendelkeznek poszttranszlációs módosításként (Vassiliadis és mtsai, 2007). A IIa osztályú mikrozinák tipikusan négy génbe szerveződnek, amelyeket nagy, alacsony kópiaszámú plazmidok kódolnak. Ide tartoznak a V (MccV, korábban ColV), L (MccL) és 24 (Mcc24) mikrozinák. Az immunitás fehérje a mikrocin közvetlen közelében kódolódik. Ezenkívül két, az exportban részt vevő fehérje képződik. A mikrozink osztályon belüli transzportfehérjék erősen homológok. Maguk a mikrozinák jellegzetes szignálpeptidekkel rendelkeznek. Az MccV és az MccL diszulfid hidakat képez. Az összes eddig említett mikrozinával ellentétben a IIb osztályú mikrozinák kromoszómásan vannak kódolva. A genetikai szervezet nagyon összetett. Példaként szolgál az E. coli Nissle 1917 probiotikus törzs, amely az M (MccM) és a H47 (MccH47) mikrozinákat alkotja (Patzer et al., 2003). A mikrozint kódoló régió 17-es gént tartalmaz
Anyagok és módszerek psym5 psym6 psym7 psym8 psym9 psym10 psym11 psym12 psym1-st76an Amp R, pilx-conjugation system, mcss, mcsi, mcsa, mcsb ez a munka ez a munka ez a munka ez a munka ez a munka ez a munka ez a munka ez a munka ez a munka ez a munka paz6 Amp R, mcss, mcsi, mcsa, mcsb ez a munka paz8 amp R, mcsi, mcsa, mcsb ez a munka paz9 cm R, mcss ez a munka paz10 cm R, ORF1 ez a munka paz11 cm R, ORF2 ez a munka paz12 cm R, rövidített mcss ez a munka paz13 Amp R, mcsi ez a munka paz14 Amp R, rövidítve mcsi ez a munka paz15 Amp R, PBAD, mcss ez a munka pgs1 Amp R, PBAD ez a munka MCS = Többszörös klónozási hely; ori TS = hőmérséklet-érzékeny replikációs origó; I-SceI = meganukleáz; FRT = Flippase felismerési cél; FLP = flippáz; ORF = nyitott olvasási keret; PBAD = arac aktivátor promoter; Amp = ampicillin; Cm = klóramfenikol; Kana = kanamicin; Tet = tetraciklin. 2.1.9 Oligonukleotidok A Biomers (Ulm) által használt oligonukleotidok listáját a függelék a 7.1. És a 7.2. Táblázat tartalmazza. 26-án
Eredmények 3 Eredmények 3.1 A baktériumok genomjának elemzése 3.1.1 Az Escherichia coli G3/10 genomja A szekvenálást a 2.2.5.1. Szakaszban leírtak szerint hajtottuk végre. Az E. coli G3/10 genom 4935403 bázisból áll. A GC-tartalom 50,88%. Az automatikus és manuális annotáció 4844 gént, 87 trna és 22 rrna átiratot azonosított. A genom kör alakú formáját a 3.1. Ábra mutatja. Az annotáció során minden kódoló szekvenciának (CDS) nevet, az úgynevezett locus tag-et, egy génnevet és egy rövid leírást tartalmazó génterméket rendeltek hozzá. A BLASTn és BLASTp elemzések és összehasonlítások a releváns adatbázisok bejegyzéseivel (Altschul et al., 1990) (források: [5,6]) szolgáltak ennek alapjául. Az olvasási kereteket automatikusan feljegyezték, és ha szükséges, manuálisan javították (lásd 2.2.5.3). Az E. coli G3/10 genomjának kezdetét a dnaa gén határozta meg. A genom jelenleg négy nagy szakaszból áll, három meghatározatlan szekvenciájú hézaggal, amelyeket PCR-rel nem lehet lezárni. A teljes genomszekvencia a közzététel után szabadon hozzáférhető lesz egy adatbázisban (Zschüttig et al., Manuscript in Preparing). 51
Eredmények 3.1. Ábra: Az E. coli G3/10 genomjának kör alakú ábrázolása. A külső gyűrű a méretezést kilobázisokban (kbp) tartalmazza. A második gyűrűben az elülső szál génjei kék színnel vannak feltüntetve. A 3. gyűrű feketével mutatja a benne található nukleáris genom génjeit. A 4. és az 5. gyűrű a komplementer szál génjeit kék színnel, a nukleáris genom génjeit fekete színnel mutatja. A két belső gyűrű mutatja a GC-tartalmat (6. gyűrű) és a GC ferdeséget (7. gyűrű), amelyek segítségével meghatározható a replikációs origó oricusa és a terc terminus. Az elülső szál és a komplementer szál nagyjából azonos számú gént tartalmaz (2. és 5. gyűrű). A maggenom génjei (3. és 4. gyűrű) mindkét szálon eloszlanak. Egyes nagyobb területek, amelyek nem tartalmazzák a mag genomjának génjeit, megfelelnek azoknak a genomi szigeteknek és prophág régióknak, amelyekben a GC tartalom bizonyos esetekben jelentősen eltér a genom átlagos GC tartalmától (6. gyűrű). Gyakran társulnak trnákkal. CDS = kódoló szekvenciák. 52
E eredmények: 3.2AE. Ábra: Az E. coli G1/2 (A), az E. coli G4/9 (B), az E. coli G5 (C), az E. coli G6/7 (D) és az E. E. E. coli G8 (E). A külső gyűrű a méretezést kilobázisokban (kbp) tartalmazza. A második gyűrűben az elülső szál génjei kék színnel vannak feltüntetve. A 3. gyűrű feketével mutatja a benne található nukleáris genom génjeit. A 4. és az 5. gyűrű a komplementer szál génjeit kék színnel, a nukleáris genom génjeit fekete színnel mutatja. A két belső gyűrű mutatja a GC-tartalmat (6. gyűrű) és a GC ferdeséget (7. gyűrű), amelyek segítségével meghatározható a replikációs origó oricusa és a terc terminus. Az elülső szál és a komplementer szál nagyjából azonos számú gént tartalmaz (2. és 5. gyűrű). A maggenom génjei (3. és 4. gyűrű) mindkét szálon eloszlanak. Egyes nagyobb területek, amelyek nem tartalmazzák a mag genomjának génjeit, megfelelnek azoknak a genomi szigeteknek és prophág régióknak, amelyekben a GC tartalom bizonyos esetekben jelentősen eltér a genom átlagos GC tartalmától (6. gyűrű). Gyakran társulnak trnákkal. CDS = kódoló szekvenciák. 56
Eredmények A Symbioflor 2-ből lokalizált E. coli genomotípusok. Az EcN-t az átlag feletti vasfelszívó rendszerek miatt különösen alkalmazkodónak tartják (Grozdanov et al., 2004). A Symbioflor 2 E. coli genomotípusai tartalmaznak néhány vasfelvevő rendszert, és ezek versenyelőnyöket teremtenek. Ezekben az E. coliban azonban nincs több vasfelvevő rendszer, mint más összehasonlítható E. coli törzsekben. 3.1.4 A Symbioflor 2 E. coli plazmidok vad típusúak, amelyek több természetes plazmidot hordoznak. Az összes tartalmazott plazmid áttekintését a 3.6. Ábra mutatja egy agaróz gélkép segítségével. 62 3.6. Ábra: Plazmidok Symbioflor 2 E. coli vad típusokban. A számozás megegyezik a plazmid nevével, pl. 3. ábra a psym3 plazmidhoz. * A psym1 a genomi DNS szintjén fut. A psym5 és a psym6 alig látható a gélképen, és feltehetően nagyon alacsony példányszámban vannak jelen. M = méret szabvány.
Eredmények A gyűrű szerkezetét kézzel zártuk be. Valószínűleg nagyon alacsony példányszámban vannak. 3.7. Ábra: Megaplasmid psym1 az E. coli G3/10-től. 40 kb hosszúságú, a plazmid 99% -ban megegyezik az uropatogén E. coli MS2027 pmas2027-gyel (Ong et al., 2009). Ezenkívül azonban egy kb. 10 kb méretű (kék színnel jelölt) területet illesztenek be, amelybe az ebben a munkában újonnan azonosított S mikrozin S kódolva van (lásd 3.2.4). A két külső gyűrű tartalmazza az előremenő és a hátramenet kódoló szekvenciáját (CDS). A GC tartalom fekete színnel jelenik meg a harmadik gyűrűben. A 4. gyűrű zöld (+) és lila (-) színnel mutatja a GC-ferdeséget. 64.
Eredmények ori endo 4000 1800 200 rom/rop 3000 psym2 4197 bps 1000 1400 1600 psym3 1934 bps 400 600 1200 800 2000 1000 csm repa 1200 6000 200 1000 1000 psym4 1304 bps 400 repa 5000 psym5 6567 bps 2000 800 4000 600 3000 ori mobc 10000 4000 8000 psym6 10433 bps 2000 psym7 4452 bps 1000 3000 6000 4000 2000 moba tnpa mobb tnpr mobd 3.8. Ábra: A Symbioflor 2 E. coli plazmidjainak plazmidtérképei a kódoló szekvenciák feljegyzésével. 65
Eredmények ORF-3 12000 2000 2000 ORF-1 ORF-1 1500 psym8 2353 bps 500 ORF-2 ORF-4 ORF-5 10000 8000 psym9 12686 bps 4000 1000 6000 ORF-8 ORF-2 ORF-7 ORF-6 1400 ori 3000 repa 200 500 1200 psym10 1549 bps 400 2500 psym11 3215 bps 1000 1000 600 2000 800 1500 orit ori mobd/mbkd mobb/mbkb 7000 6000 1000 moba/mbka 5000 psym12 7111 bps 2000 csa mobc/mbkc 4000 3000 oriv csl csi 3.8. ábra: Plazmidkártyák a Symbioflor 2 E. coli-ban található plazmidok közül a kódoló szekvenciák feljegyzésével. (Folytatás). 66
3.9. Ábra: A kifejlesztett törzs- és csoportspecifikus PCR-ek specifitásának ellenőrzése E. coli G1/2, G6/7 és G8 (A), E. coli G3/10 (B), E. coli G4/9 (C) és E. coli G5 (D). A kapott sávok piros színűek. A számok (#) a Gunzer munkacsoport törzskollekciójára utalnak. M = méret standard, NK = negatív kontroll.
Eredmények 3.5. Táblázat: A Symbioflor 2 E. coli genomok áttekintése (2012. január). Genotípus E. coli G1/2 E. coli G3/10 E. coli G4/9 E. coli G5 E. coli G6/7 E. coli G8 A plazmidok száma Becsült kromoszómahossz [bp] 1 Becsült genomhossz [bp] 1.2. 1 Becsült gének száma 2 Trna 2 száma 4 748 500 4 757 160 36 4478 82 22 6 4 935 403 5 010 410 4 4 844 87 22 1 4 514 694 4 515 998 29 4 163 72 22 5 4 578 897 4 603 537 43 4 296 84 22 2 4 978 623 4 987 283 41 4 729 81 22 2 4 873 886 4 882 546 62 4 636 73 22 szám rrna 1 Az értékek megegyeznek a mai napig kijelölt feltételekkel. 2 A genom a kromoszómából és a plazmidokból áll. E. coli G4/9 E. coli G5 E. coli G3/10 E. coli G6/7 E. coli G8 E. coli G1/2 3.10. Ábra: A Symbioflor 2 E. coli genom-összehasonlítása (2012. január). A filogenetikai fát az EDGAR (Blom et al., 2009) segítségével állítottuk elő, és a maggenomok alapján. 70
Eredmények 3.31. Ábra: A mikrozin H47 gén szkrínelése különböző EHEC törzsekben. Különböző EHEC törzseket, EcN és E. coli G3/10 teszteltünk az mchb_bamhi és mchb_sphi primerekkel. A mikrozin H47 gént az EHEC DD, FO1 és FO2 törzsekben detektáltuk. PK = pozitív kontroll, NK = negatív kontroll. 3.2.4.7 A fehérje szerkezetének és osztályozásának elemzése Az E. coli G3/10-ben azonosított mikrozin S (MccS) egy 120 AA fehérje, amelynek számított molekulatömege 11,67 kda. A mikrozin kifejezést kisméretű, molekulatömegű antibakteriális peptidekre vonatkoztatták