Értekezés a tudományos fokozat megszerzéséhez
A D-vitamin gén haplotípusai, mint a vastagbél karcinóma érzékenységi tényezői, valamint a D-vitaminnal szabályozott gének in vitro expressziójának elemzése Értekezés a Természettudományok doktorának (Dr. rer. Nat.) Tudományos fokozatának megszerzéséhez Beadva a Biológiai Tanszéken, Kémia, Gyógyszerészet a Berlini Szabadegyetemen Jana Flügge, Greifswald előadója, 2008. november 1. Lektor: Prof. Dr. Matthias F. Melzig 2. bíráló: Prof. Dr. Ivar Roots vitája 2009. február 26-án
Köszönetnyilvánítás, amelyet az SNPlex vizsgálatok hoztak létre, hajtottak végre és értékeltek. Külön szeretnék köszönetet mondani Biol. Sabrina Klare diplomának az SNPlex elvégzéséért, dr. Solveigh Krusekopf az SNPlex létrehozásához és kiértékeléséhez, valamint Anne Sülflow asszony és Biol. Dipl. Kristin Krostitz 3 SNP szekvenálásához. Ezt a doktori fokozatot pénzügyileg támogatta a Szövetségi Oktatási és Kutatási Minisztérium (InnoRegio projekt, 03I4507 támogatásszám, a gyógyszeres terápia farmakogenomikai optimalizálása és a vastagbélrák gyógyszerfejlesztési alprojektje) és az Investitionsbank Berlin (ProFIT projekt, 1013 3117 támogatásszám, a vastagbélrák egyedi kockázati tényezői, figyelembe véve a polimorf genetikai társulási teszteket köztük nagyszámú mutáció). Külön köszönetemet szeretném kifejezni szüleimnek, Dr. Dipl.-Ing. Frank Flügge és Dipl.-Ing. Evelyn Flügge, a húgom, Dipl.-Chem. Susanne Flügge, nagymamám, Herta Flügge, valamint nagyszüleim, Günter Buckow és Christel Buckow értékes támogatásukat fejezik ki a tanoncképzésem teljes ideje alatt, az iskolától kezdve a tanulmányokon át a doktori fokozatomig, valamint a támogatásért és bátorításért minden hullámvölgyben. Munka. II
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás. I Tartalomjegyzék. III A rövidítések listája. VII 1 Bevezetés. 1 1.1 Kolorektális carcinoma. 1 1.1.1. Előfordulás és halálozás. 1 1.1.2 Az adenoma-carcinoma szekvencia patogenezise. 1 1.1.3 Egyéni és környezeti kockázati tényezők, elhelyezés és expozíció. 2 1.1.4 Genetikai tényezők és hajlam. 4 1.2 D-vitamin 5 1.2.1 Tulajdonságok. 5 1.2.2 D-vitamin anyagcsere. 6 1.2.3 A D-vitamin és a vastagbélrák kapcsolata. 7 1.3 D-vitamin receptor. 8 1.3.1 Felépítés, felépítés és előfordulás. 8 1.3.2 Működési mód. 10 1.3.3 A D-vitamin receptor gén polimorfizmusai, asszociációi és molekuláris jellemzése. 11 1.3.4 D-vitamin receptor poli (A) mikroszatellit. 12 1.3.5 A D-vitamin metabolizmusában szerepet játszó gének polimorfizmusai. 13 1.4. 14 2 Anyag és módszerek. 15 2.1 Anyagok. 15 2.1.1 Vizsgálja meg a populációkat. 15 2.1.2 Sejtvonalak. 18 2.1.3 Eszközök. 18 2.1.4 Vegyszerek. 20 2.1.5 Megoldások. 23 2.1.6 Fogyóeszközök. 23 III
Tartalomjegyzék 3 eredmény. 57 3.1 VDR génpolimorfizmusok. 57 3.1.1 Klinikai adatok. 57 3.1.2 A genotipizálás eredményei. 58 3.1.3 VDR genotípus párok. 59 3.1.4 VDR-csatolási egyensúlyhiány. 60 3.1.5 VDR haplotípusok. 61 3.1.6 D-vitamin receptor poli (A) mikroszatellit. 63 3.2 A D-vitamin metabolizmusában szerepet játszó gének polimorfizmusai. 67 3.2.1 Klinikai adatok. 67 3.2.2 A multiplex elemzés eredményei. 68 3.2.3 A genotípusok összefüggései. 72 3.2.4 Kapcsolódási elemzés. 72 3.2.5 Komplex genotípusok és haplotípusok. 74 3.3 Gén expressziós elemzés RT-PCR-rel. 77 3.3.1 Indukciós kísérletek (differenciálódási modell). 77 3.3.2 Az mrna relatív számszerűsítése. 78 3.3.3 VDR-génexpresszió Caco-2 sejtekben. 79 3.3.4 CDH1 gén expresszió Caco-2 sejtekben. 80 3.3.5 VDR génexpresszió SW480 sejtekben. 81 3.3.6 CDH1 gén expresszió SW480 sejtekben. 82 3.4 Génexpresszió-elemzés GeneChip mikroray-kel. 83 3.4.1 Klaszterelemzés. 83 3.4.2 A szabályozott gének adatelemzése (biztonsági szintek). 84 3.4.3 A szabályozott gének hozzárendelése. 85 3.4.4 Szóródási ábra. 85 3.4.5 Hierarchikus klaszterelemzés. 86 3.4.6 Kiválasztott D-vitaminnal szabályozott gének elemzése. 88 4 Megbeszélés. 92 4.1 VDR génpolimorfizmusok. 92 4.1.1 A D-vitamin gén polimorfizmusainak hatása a vastagbél karcinóma iránti érzékenységre (eset-kontroll tanulmány). 92 V
Tartalomjegyzék 4.1.2. A kötési egyensúlyhiány, a komplex genotípusok és a haplotípusok hatása. 95 4.2 A D-vitamin metabolizmusában szerepet játszó gének polimorfizmusai. 100 4.3 Gén expressziós elemzés. 102 4.3.1 A génexpresszió-elemzés eredményeinek értelmezése RT-PCR-rel sejttenyészetekben történő indukció után (differenciálódási modell). 102 4.3.2 Műszaki problémák és hordozhatóság. 104 4.3.3 Referencia- és jelöltgének megválasztása. 105 4.3.4 A mikroarray eredmények minőségellenőrzése és adatelemzése. 106 4.3.5 VDR és CDH1 expresszió mikroarray elemzés után. 106 4.3.6 A génexpresszió-elemzés eredményeinek értelmezése GeneChip mikroray-vel. 107 4.3.7 A génszabályozás modellje D-vitaminnal 112 4.4 Kilátások és perspektívák. 113 5 Összegzés. 114 6 Irodalomjegyzék. 118 7 Publikációk listája. 132 CV. 134 Nyilatkozat. 135 VI
Rövidítések listája Rövidítések listája Rövidítés Acc. Nem. ACTB ATRA β-me bp BMI BSA CDH1 CDS CI crna CV CYP CYP24A1 CYP27A1 CYP27B1 d ddntp DMEM DMSO DNS dntp dsdna EDTA EtOH fcrna FCS Jelentés Hozzáférési szám béta-aktin all-transz-retinsav béta-merkaptoetanol bázispár Testtömeg-index Szarvasmarha-szérumalbumin E-kadherin kódoló szekvencia Konfidencia intervallum komplementer RNS Variációs koefficiens Citokróm P-450 Citokróm P-450 24A1 (citokróm P450, 24. család, A alcsalád, 1. polipeptid), vitamin -D 3-24-hidroxiláz citokróm P-450 27A1 (citokróm P450, 27. család, A alcsalád, 1. polipeptid), D-vitamin 3-25-hidroxiláz citokróm P-450 27A1 (citokróm P450, 27. család, B alcsalád), 1-es polipeptid), 25-hidroxi-vitamin-D 3-1-alfa-hidroxiláz 2,3-dideoxinukleotid Dulbecco s Modified Eagle s közepes dimetil-szulfoxid-dezoxiribonukleinsav-dezoxiribonukleotid-5-trifoszfát-kettős szálú DNS-etilén-diamin-tetraacetát-etanol-fragmens m (magzati borjúszérum) VII
Rövidítések listája g g GAPDH gdna Gl. h hap hm ht HWE fej. kb KG LD M MAF MES mrna mut MW n N.A. NaB NaCl n.d. NR n.s. nt OD OR PBS PCR QC gravitációs gyorsulás gramm glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz genomi DNS-egyenlet óra haplotípus homozigóta heterozigóta Hardy-Weinberg egyensúlyi fejezet kilobázis párok komplex genotípusok RNS (messenger RNS) mutált átlagos érték mintaméret nincs megadva nátrium-butirát nátrium-klorid nem detektálható nukleáris receptorok nem szignifikáns nukleotidok optikai sűrűség esélyhányados foszfáttal pufferolt sóoldat polimeráz láncreakció minőségellenőrzés VIII
R rövidítések listája r Korrelációs együttható RAR retinsav receptor RNS ribonukleinsav RFLP restrikciós fragmens hossza polimorfizmus RLT puffer, erősen denaturáló guanidin-izotiocianát (GITC) fordulat/perc fordulat (fordulat/perc) ROH retinol rrna riboszomális RNS RT-fordított transzkripció Svedberg (egység, ülepedési együttható) SD standard deviáció (szórás) sec másodperc ssdna egyszálú DNS (egyszálú) SNP egy nukleotid polimorfizmus Taq Thermus aquaticus TBE Trisz-borát-EDTA puffer TE Tris-EDTA puffer Tris Tris- (hidroxi-metil) ) -aminometán trna transzfer-RNS U egység, egység UV ultraibolya fény VDR D-vitamin receptor vad típusú 1α típusú, 25 (OH) 2 D 3 D-vitamin, 1,25-dihidroxi-D-vitamin, kalcitriol 3 -, 5 -UTR 3 -, 5 - nem transzlált régió 7-DHC 7-dehidrokoleszterin IX
Anyag és módszerek a ggmbh i.gr. intézetnél, Berlin-Hennigsdorf. A tumor jellemzőinek és a TNM osztályozásának áttekintését a 3. táblázat tartalmazza. 3. táblázat: A tumor lokalizációja, a tumor szövettana és a TNM osztályozása 452 vastagbélrákos betegnél (II. Csoport). Csökkenő vastagbél 16 3,5 Sigmoid vastagbél 102 22,6 Végbél 214 47,3 Egyéb 11 2,4 Tumor szövettan Adenocarcinoma 414 91,6 Mucinous adenocarcinoma 28 6,2 Egyéb 10 2,2 Differenciálódási fok Gyenge 78 17,2 Mérsékelt 330 73,0 Jó 31 6,9 Differenciálatlan 13 2,9 Daganat stádium (pt) pt1 Submucosa 22 4,9 pt2 Muscularis propria 109 24,1 pt3 Subserosa 267 59,1 pt4 Egyéb szervek/perforációk 54 11,9 Nyirokcsomó áttétek (pn) pn0 Nincs áttét 211 46,7 pn1 1-3 nyirokcsomó 126 27,9 pn2 4 vagy több nyirokcsomó 102 22,5 Egyéb 13 2,9 Távoli áttétek (pm) pm0 Nincsenek távoli áttétek 346 76,6 pm1 Távoli áttétek 100 22,1 Egyéb 6 1,3 A kontroll csoport nem malignus betegségben szenvedő betegekből állt. A mintákat a Charité Universitätsmedizin Berlin Klinikai Farmakológiai és Toxikológiai Intézete gyűjtötte össze. A vizsgálat minden résztvevőjét tájékoztatták a vizsgálat tartalmáról és céljairól, és írásos beleegyezésüket adták. 17-én