Fehérje címkézés Hogyan válasszunk címkét a fehérjéhez
Sara Klink
Megjelenés dátuma: 7/2019; tpub_215
Absztrakt
A fehérje elemzés fontos szempontja a fehérje jelölése. Az, hogy a fehérjét különféle alkalmazásokhoz címkézheti, beleértve a tisztítást, lehúzható teszteket, immunvizsgálatokat és még sok mást, segíthet meghatározni a fehérje működését. De melyik címkét válassza? Ez a cikk az affinitás- vagy riporteralapú címkék és reagensek számos lehetőségét ismerteti, amelyek segíthetnek a kísérletekben.
Bevezetés
A fehérjék vagy polipeptidek szerves részét képezik a sejtfunkciónak. Ezek az enzimek alkotják az energia-anyagcsere, a sejtnövekedés, a jelátvitel, a mitotikus ciklus és a sejtpusztulás útjait. A specifikus fehérjék izolálása és kimutatása lehetővé teszi számunkra, hogy megértsük, mely fehérjék a nagyobb komplexek részei, melyek a fehérjék kölcsönhatásban vannak, és milyen szerepet töltenek be a sejtműködésben és a betegségben. A fehérje működésének megvizsgálásának egyik módja az, ha a fehérje tanulmányozásához hozzáad egy címkét az érdeklődő fehérjéhez, és elválasztja egy sejtlizátumtól.
A fúziós címkék lehetnek polipeptidek, kis fehérjék vagy enzimek, amelyek hozzá vannak adva egy fehérje amino (N) vagy karboxi (C) végéhez. A jelölés történhet vektorokba történő klónozással, vagy hozzáadható CRISPR-Cas9 génszerkesztéssel az endogén fehérje jelöléséhez. Az affinitás címke használatával izolálhat vagy immobilizálhat egy fehérjét további proteomikai vizsgálatokhoz.
Míg a kutatók általában megcímkéznek egy fehérjét, hogy megtisztítsák egy sejtlizátumtól, és az izolált fehérjét biokémiai vizsgálatokban használják, a peptidjelölő többet tehet. Például az epitóp-tagjelölt fehérjék egy tag-specifikus antitesttel detektálhatók, ha nincsenek a fehérjére specifikus antitestek. Ezenkívül a címkék kvantitatívan meghatározhatják a fehérjéket, tanulmányozhatják a fehérjekomplexeket és meghatározhatják, hogy a fehérje a sejten belül vagy kívül található-e. Akár vizualizálhatja a fehérje elhelyezkedését egy sejten belül, a fehérjéjén található címke miatt.
Tehát melyik fehérje címke megfelelő a kísérleteihez? Az alábbiakban felsoroljuk azokat a lehetőségeket, amelyek segítségével a fehérjéket segíthetik olyan eszközökkel, amelyek segíthetnek.
Poliisztidinek
Az egyik legegyszerűbb és legkisebb címke a polihisztidin vagy 6XHis címke. Ez a peptidjelző általában hat hisztidin-aminosavból áll, amelyek elhelyezhetők egy fehérje N- vagy C-terminálisán. Kis mérete miatt az His címke általában nem változtatja meg a fehérje szerkezetét, ami hasznos a downstream vizsgálatoknál. Ezenkívül az His címke olyan fémionokhoz képes kötődni, mint a Ni 2+, Zn 2+ és Cu 2+, ezáltal hasznos lehet fúziós fehérjék tisztítására vagy immobilizálására.
A polihisztidin-címke jól működik az E. coliban expresszált fehérjék gyors tisztításához, de emlős- vagy rovarsejtekben expresszált fehérjék esetében a hisztidin-maradékok nagyobb száma azt jelenti, hogy magasabb a háttér-kötődés. Ezért a fehérje tisztaságának növelése érdekében a His-jelölt fehérjéket megkötő fémgyantákat szigorúan meg kell mosni. Ezenkívül denaturáló szereket, például 8 M karbamidot vagy 6 M guanidin-HCl-t is használhatunk His-jelölt membránnal vagy oldhatatlan fehérjékkel a tisztítás javítása érdekében.
Ha hozzá szeretné adni az His címkét a fehérjéhez, klónozza az ORF-et egy vektorba, amely a címkét hordozza. Az alkalmazott promótertől függően expresszálja a jelölt fehérjét bakteriális, emlős vagy rovar sejtekben. Alternatív megoldásként használhatunk sejtmentes expressziós rendszereket a fehérje expresszióhoz. A fehérje tisztításához mágneses gyöngyöket (például MagneHis ™ protein tisztító rendszert) vagy nem mágneses gyantákat (például HisLink ™ protein tisztító rendszert) használhat a sejtek lizátumaihoz. Ha His-jelölt fehérjéje egy nyúl retikulocita lizátum alapú rendszerben expresszálódik, akkor a MagZ ™ fehérjetisztító rendszer hasznos minimális hemoglobinszintű fehérjetisztításhoz. A tisztító mátrixból eluálva a jelölt fehérje felhasználható a további vizsgálatokhoz.
Polihisztidinnel jelölt fehérjetisztítás
Glutation-S-transzferáz
A glutation-S-transzferáz (GST) egy affinitásjelző, amelyet az E. coliban expresszált fehérjékhez használnak a jelölt fehérjék bakteriális lizátumokból történő megtisztítására. Ez a 26 kDa méretű peptid tag az eukariótákban jelen lévő cisztol fehérjék családjába tartozik, így kevésbé hasznos, amikor más fehérjék versengése miatt próbálják izolálni a fehérjéket az eukarióta sejtektől. Az eukarióta fehérjék GST-vel történő megjelölése fokozza a fúziós fehérjék oldhatóságát, ha baktériumokban expresszálódnak. Ezenkívül a GST-vel jelölt fehérjék magas szinten expresszálódhatnak a baktériumokban, de a fehérje aggregációja miatt zárványtesteket képezhetnek. A GST tag hozzáadható a kívánt fehérje N- vagy C-terminálisához.
A GST erős affinitással rendelkezik a glutationra, ami azt jelenti, hogy rögzítheti a GST fehérje fúzióit egy immobilizált mátrixon, például a glutationnal bevont gyöngyökön. Ezt a kötési jellemzőt használják fehérje tisztítására, valamint olyan fehérjék megkötésére, amelyek kötődhetnek a fehérjéhez (pl. Lehúzási vizsgálatok).
Míg a GST-jelöléssel rendelkező fehérjék erősen expresszálódhatnak és jobban oldódhatnak, a tag nagy mérete zavarhatja a fehérje működését a downstream alkalmazásokban. Lehetséges, hogy leválaszthatja a fehérjét a GST tagről, csökkentve ezzel az esetleges funkcionális interferenciát. Ha az expresszált fehérje inklúziós testbe aggregálódott, akkor a glutation alkalmazásával végzett affinitás-tisztítás problematikussá válik. A glutationhoz való sikeres kötődéshez a GST-t helyesen kell hajtogatni, és akkor is, ha a GST-címke újratekeredik, előfordulhat, hogy az érdekes fehérje nem.
A GST címke használatához kezdje úgy, hogy egy vektorba klónozza a kérdéses fehérje kódoló régióját, és expresszálja a jelölt fehérjét E coliban. Indukálható promóter használata a célfehérje-expresszió szabályozásához segíthet a baktériumsejtekre mérgező fehérjéknél. Miután a baktériumsejtek lizálva vannak (például a FastBreak ™ sejtlízis reagenssel), megtisztíthatjuk a GST-vel jelölt fehérjét glutation-alapú gyanta (pl. MagneGST ™ Protein Purification System) segítségével. Az alkalmazott klónozóvektortól függően lehet egy hasítási hely egy proteáz számára, amely eltávolítja a fehérjéből a GST taget. Miután a fehérje eluált vagy hasított, készen áll az elemzésre.
Tisztító GST-fehérje fúziók
HaloTag® fehérje
Míg a GST és a 6XHis tagek hasznosak a baktériumsejtekben expresszált fehérjék izolálásához, vannak olyan jelölési lehetőségek, amelyek kompatibilisek mind az E. coli, mind az emlős sejtekkel. A 34kDa HaloTag® fehérje ezt az expressziós rendszer rugalmasságát kínálja. A fehérjék tisztításához nem kovalens kölcsönhatásokat alkalmazó más tagekkel szemben a HaloTag® technológia alapja a HaloTag® fehérje és liganduma közötti kovalens kötés. A kovalens kötés erőssége miatt szigorú körülmények között kimoshatja a jelölt fehérjét, és alapvetően kiküszöböli a nem specifikus fehérje hátterét. Aggódik a fehérje működését befolyásoló címke mérete miatt? Nincs mit! Csak használjon TEV proteázt a fehérje HaloTag-ból való hasításához, és a tisztított, nem jelölt fehérje felhasználásra kész a későbbi elemzés során.
A fehérjék baktériumsejtekben történő expressziójának egyik kihívása az oldhatóság. Az eukaroyt fehérjék nem metilálódnak, és más poszttranszlációs módosítások hiányoznak az E. coliban szintetizálva, ami hajlamos az inklúziós testek kialakítására. Az olyan fúziós címkék, mint a HaloTag® fehérje, oldhatóbbá tehetik a rekombináns fehérjéket, és még fokozhatják a baktériumok expresszióját, megkönnyítve ezzel a kívánt fehérje tisztítását. A HaloTag-fehérje fúziójának emlős sejtekben történő expressziójával poszttranszlációs módosítások lesznek jelen, amelyek jobban tükrözik, hogy a fehérje hogyan fog működni sejtes körülmények között. A HaloTag® ligandummal bevont immobilizált mátrix, például a HaloTag® ligandummal bevont gyanta segítségével csak a HaloTag jelenlétében lévő fehérjéket tisztíthatja, vagy lehúzható vizsgálatokban használhatja fel annak kiderítésére, hogy milyen fehérje vagy fehérjék kötődnek az Ön érdeklődő fehérjéhez. Ily módon jobban megértheti a fehérje kölcsönhatásokat.
De az alkalmazások nem állnak meg a fehérjéknél: a fehérje kölcsönhatások és a fehérje tisztítása. Ha meg akarja vizsgálni, hogy a fehérje milyen DNS-szekvenciához kötődik, a HaloTag® technológia segíthet a fehérje: a DNS interakció megfejtésében. Mit kell használni az immunokémiát? Van ellenanyagunk erre. Érdekel a sejtképalkotás? Ha a fehérje összeolvad a HaloTag® fehérjével és a fluoreszkáló HaloTag® ligandumokkal, akkor megtudhatja, hol lokalizálódik fehérje, ha forgalmazzák és milyen gyorsan fordul át. Még szuperfelbontású mikroszkópiához és FACS-hez is vannak ligandumok. Tudjon meg többet a HaloTag® technológiáról itt.
A HaloTag® technológia használatának megkezdéséhez klónozza az érdeklődésre számot tartó fehérje kódoló régióját hagyományos vagy Flexi® klónozó vektorokba, hogy hozzáadja a HaloTag-ot az N vagy a C végén. Alternatív megoldásként megkeresheti a Kazusa több ezer előre gyártott HaloTag® klónját. Miután megvan a klónja, bármely fehérjeelemzési alkalmazáshoz felhasználhatja. Attól függően, hogy mit szeretne tovább csinálni, szüksége lehet tisztító rendszerre (pl. HaloTag® emlős fehérje tisztító rendszer vagy HaloTag® fehérje tisztító rendszer) vagy lehúzható tesztre (pl. HaloTag® emlős lehúzható rendszerek). A képalkotó vizsgálatokhoz ki kell választania a megfelelő fluoreszcens ligandumot (pl. HaloTag® Ligands vagy Janelia Fluor® HaloTag® Ligands). Ha érdekli az immunológiai vizsgálatok, az Anti-HaloTag® pAb segít. A fehérje interakciókhoz létezik a NanoBRET ™ PPI Systems for protein: protein interact Studies és HaloCHIP ™ System for protein: DNA interactions.
HaloTag® cserélhető címkézési technológia
1. ábra: Ez az ábra azt mutatja be, hogy a HaloTag® fehérje hogyan fuzionálódik egy érdekes fehérjéhez, valamint a HaloTag és annak liganduma közötti kovalens kötéshez.
Míg a korábban tárgyalt peptidjelölők többsége affinitásjelző a fehérje tisztításában, lehúzható vizsgálatokban vagy olyan módszerekben, amelyek a jelölt fehérjét szilárd mátrixhoz kötik, vannak más típusú címkék is különböző alkalmazásokhoz. A fehérjék számszerűsítésétől az endogén jelölésig biolumineszcens jelölés vagy akár egy fehérjéhez fuzionált kis riporterfehérje is használható a jelölt fehérje nyomon követésére a sejtben, megszüntetve az antitestek szükségességét.
HiBiT
A kisebb sok esetben jobb, és egy apró, 11 aminosavból álló HiBiT nevű peptid címke kiválóan alkalmas fehérje jelölésére. Ha el akarja hagyni a hagyományos klónozást, akár a CRISPR génszerkesztést is felhasználhatja a HiBiT címke hozzáadásához egy endogén fehérjéhez. Ennek az az előnye, hogy egy fehérjét túlexpresszió nélkül vizsgálnak, amelyet általában egy plazmid exogén expressziójának alkalmazásakor tapasztalnak. Ha a sejtfehérjéket a sejtben azonos arányban tartja, akkor fiziológiai körülmények között tanulmányozhatja a jelölt fehérje változását. Ez az előny kevesebb fehérje túltermelésből származó artefaktust és több biológiailag releváns eredményt jelent. A peptidcímke hozzáadásához szükséges CRISPR protokoll egyszerű és kicsi, ha a HiBiT magas szerkesztési hatékonyságot kínál.
A HiBiT önmagában nem biolumineszcens. Ha azonban hozzáadunk egy detektáló reagenst, amely a komplementer LgBiT fehérjét tartalmazza, akkor fényes lumineszcens jel jön létre. A számszerűsíthető jelet könnyű mérni luminométerrel. A biolumineszcens vizsgálatok érzékenyek és akár nanomoláris szintig is kimutathatók. Meg akarja vizsgálni az extracelluláris vagy szekretált fehérjéket? Van erre reagens rendszerünk! Kombinálja az összes jelölt fehérje mennyiségi meghatározását a mi lytikus rendszerünkkel, és vizsgálja meg a szekretált fehérje szintjét az extracelluláris rendszerünk segítségével, sőt megszüntetheti az antitest szükségességét, és biolumineszcens blot rendszerünk segítségével felismerheti a membránra folt fehérjéket. Ha az LgBiT intracellulárisan expresszálódik, kinetikailag kimutathatja az élő sejtekben a HiBiT-vel jelölt fehérje-bőséget. Itt megtudhatja, hogyan használhatja a HiBiT-t a fehérje címkézésére.
A HiBiT használatának megkezdéséhez klónozhatja ORF-jét a hagyományos MCS vagy Flexi® vektorok egyikébe, vagy CRISPR módszerrel hozzáadhatja a címkét a genomi szekvenciához. Helyezze a címkét oda, ahol az optimális észleléshez szükség van. Miután a fehérjét HiBiT-vel jelölte meg, határozza meg, hogy melyik módszer működik a legjobban a tanulmányai során (Nano-Glo® HiBiT Lytic, Intracellularis vagy Blotting Systems).
A Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System áttekintése
NanoLuc® luciferáz
Néha csak egy riporter fog tenni. Szerencsére a NanoLuc® luciferáz egy 19 kDa méretű enzim, így a biolumineszcens fehérje elég kicsi ahhoz, hogy egy másik fehérjével útra keljen anélkül, hogy megzavarná a normális sejtfunkciókat. A HiBiT-hez hasonlóan a NanoLuc érzékeny, könnyen számszerűsíthető fehérje-fúziós címkét biztosít. A riporter enzimnek azonban nincs szüksége komplementer partnerre, ez egyes alkalmazásokban egyszerűsíti használatát. A fényerő és a kis méret azt jelenti, hogy a NanoLuc® luciferáz nehézségek nélkül elfér a vírusrészecskékben. Olvassa el, hogy ezek a virológiai kutatók hogyan csinálták. Riporter enzimként a NanoLuc® luciferase segíthet felismerni a fúziós fehérje sejtek elhelyezkedését, valamint nyomon követheti a fehérje útját. Ezenkívül a NanoLuc® fúziós fehérjék felhasználhatók biolumineszcenciás rezonancia energiaátadás (BRET) alapú alkalmazásokban a fehérje tanulmányozásához: fehérje kölcsönhatások vagy kismolekulájú célmegkötések. Tudjon meg többet a riporter enzim képességeiről.
A fehérje-fúzió létrehozásához a NanoLuc® luciferázzal klónoznia kell az ORF-jét egy NanoLuc® riporter vektorba, a NanoLuc-ot az N vagy a C végére helyezve. Alkalmazásától függően használhat lítikus detektáló rendszert (pl. Nano-Glo® Luciferase Assay System) vagy élő sejt detektálási vizsgálatot (pl. Nano-Glo® Live Cell Assay System).
Összegzés
A fehérje címkéjének kiválasztása a kísérleti igények alapján történik. Akár affinitásjelzőre van szüksége a fehérje tisztításához, akár egyetlen fúziós fehérjét szeretne létrehozni, amelyet különféle fehérje-analízis módszerekben használnak, vagy endogén tagot szeretne hozzáadni a CRISPR-Cas9 génszerkesztéssel, számos címke és riporter enzim áll rendelkezésre.