Genomok
Jürgen Markl
12 Molekuláris Élettani Intézet, Johannes Gutenberg Egyetem, Mainz, Németország
Szadava Dávid
13 Keck Science Center, Claremont, Kalifornia, USA
David M. Hillis
14 Texasi Egyetem, Austin, Austin, TX, USA
H. Craig Heller
15 Stanford Egyetem, Stanford, Kalifornia, USA
Sally D. Hacker
16 Oregoni Állami Egyetem, Corvallis, OR, USA
Andreas Held
Jarosch Birgit
7 Jarsoch Text, Aachen, Észak-Rajna-Vesztfália, Németország
Lothar Seidler
Monika Niehaus-Osterloh
Sixt Éva
10 München, Bayern Németország
Matthias Delbrück
Lenyűgöző kutatás: A kutya genom projekt
A házi kutyát, a Canis lupus familiarist körülbelül 15 000 évvel ezelőtt háziasították az emberek. Bár a farkasoknak sokféle fajtája létezik, meglehetősen hasonlóak, de ez nem az „ember legjobb barátja”. A Fédération Cynologique Internationale (FCI), a világ legnagyobb kutyatenyésztő ernyőszervezete több mint 300 kutyafajtát ismer el. A genetikusok körülbelül 100 valódi kutyafajtát feltételeznek, a többi fajta. A kutyafajták nem csak egészen másképp néznek ki, hanem magasak is. Például az átlagos chihuahua csak 1,5 kg, míg egy skót kutya 70 kg. Egyetlen másik emlős sem mutat ilyen nagy fenotípusos változékonyságot. A kutyáknál is több száz genetikai betegség fordul elő, és közülük soknak emberben van a megfelelője. A kutya genom projekt az 1990-es évek végén kezdődött, hogy megtudja, mely gének felelősek a genetikai variabilitásért, valamint hogyan kapcsolódnak a gének és a betegségek.
Lenyűgöző kutatás: A kutya genom projekt
A házi kutyát, a Canis lupus familiarist körülbelül 15 000 évvel ezelőtt háziasították az emberek. Bár a farkasoknak sokféle fajtája létezik, meglehetősen hasonlóak, de az „ember legjobb barátjával” nem ez a helyzet. A Fédération Cynologique Internationale (FCI), a világ legnagyobb kutyatenyésztő ernyőszervezete több mint 300 kutyafajtát ismer el. A genetikusok feltételezik, hogy körülbelül 100 valódi kutyafajta létezik, a többi fajta. A kutyafajták nem csak egészen másképp néznek ki, hanem magasak is. Például az átlagos chihuahua csak 1,5 kg, míg egy skót kutya 70 kg. Egyetlen másik emlős sem mutat ilyen nagy fenotípusos változékonyságot. A kutyáknál is több száz genetikai betegség fordul elő, és közülük soknak emberben van a megfelelője. A kutya genom projekt az 1990-es évek végén kezdődött, hogy megtudja, mely gének felelősek a genetikai variabilitásért, valamint hogyan kapcsolódnak a gének és a betegségek.
Az első két kutya, amelynek genomja teljesen szekvenálódott, egy ökölvívó és egy uszkár volt. A kutya genom DNS-e 2,8 milliárd bázispárt tartalmaz 39 kromoszómapárban. 19 000 fehérjét kódoló gént tartalmaz, amelyek többségének megfelelője van más emlősökben, beleértve az embereket is. A teljes genomszekvencia felhasználásával elkezdték feltérképezni a genetikai markereket - specifikus rövid DNS-szekvenciákat - a genom bizonyos pozícióiban, amelyek különböznek az egyes kutyáktól vagy kutyafajtáktól.
Genetikai markerek bizonyos jellemzőket kontrolláló gének lokalizálására (és így azonosítására) szolgálnak. Például Elaine Ostrander és kutatócsoportja portugál vízi kutyákat tanulmányoz a testméretet szabályozó gének azonosítására. A sejtek eltávolítása a DNS-izoláláshoz viszonylag egyszerű volt: egy pamut törlővel végighúzta az arcát. Az inzulinszerű 1-es növekedési faktor (IGF-1) génje fontosnak bizonyult a magasság meghatározásában: a nagy fajtáknak van egy allélja, amely az aktív IGF-1-et kódolja, míg a kis fajtáknak van egy allélja hordozzon egy kevésbé aktív IGF-1 allélt.
Ahogy az várható volt, egyes tudósok cégeket alapítottak a kutyák genetikai variánsainak tesztelésére a DNS alapján, és így megerősítették a fajta tisztaságát az érintett kutyatulajdonosok előtt. Hasonlóképpen, a házimacska, a vadmacska és a különféle nagymacskafajok genomját szekvenálták. Ezeknek az állatgenomoknak az összehasonlítása segít meghatározni a különböző emlősvonalak evolúciós történetét, valamint azonosítani azokat a géneket, amelyek felelősek a betegségekért és a vonásformákért, mivel ezek előfordulnak a különböző emlősfajokban. Az ilyen vizsgálatok természetesen nem korlátozódnak az emlősökre, az állatvilágban vannak genomprojektek, valamint növényekkel, gombákkal, sok más eukarióta és számos prokarióta.
Milyen ismereteket szereztünk az állatok genomjának szekvenálásával?
Erre a kérdésre talál választ a „Kísérlet: A tigris genom összehasonlító elemzése” részben a 17.1 szakaszban, valamint a „Fascination Research” részben a fejezet végén.
A genomokat most nagyon gyorsan lehet szekvenálni
Ban,-ben Genomszekvenálás meghatározzuk az élőlény teljes genomjának nukleotidszekvenciáját. Egyetlen kromoszómával rendelkező prokariótában a genomszekvencia bázispárok folytonos szekvenciája (bp). Diploid, nemi úton szaporodó fajokban, több autoszómával és pár nemi kromoszómával (10.1007/978-3-662-58172-8_12 # Sec22. Szakasz) a „szekvenált genom” kifejezés általában a haploid összes bázisának szekvenciájára utal. Autoszómakészlet és a két nemi kromoszóma (emberben 22 + 2, kutyában 38 + 2).
Dióhéjban
A genomokat rövid fragmensek formájában szekvenálják, amelyeket átfedések segítségével egymáshoz térképeznek.
A funkcionális genomikában a szekvenciainformációt használják a genom különböző részeinek funkcióinak meghatározására.
Az összehasonlító genomikában összehasonlítjuk a különféle szervezetek genomszekvenciáit.
A DNS-szekvenálási technológia fejlődésével a genetikai információk robbanása történt, amelyeket a tudósok sokféle módon felhasználhatnak.
Összehasonlíthatjuk a különféle fajok genomjait, hogy lássuk, miben különböznek a DNS szintjén. Ez az információ felhasználható az evolúciós kapcsolatok megértésére.
Összehasonlíthatjuk egy fajon belül az egyedek szekvenciáját, hogy azonosítsuk azokat a mutációkat, amelyek adott fenotípusokat okoznak.
A szekvencia információk felhasználhatók bizonyos típusú tulajdonságok génjeinek azonosítására, például a betegségekkel összefüggő génekre.
Megtalálható a fehérjét kódoló gének DNS-szekvenciája, és ebből levezethető az érintett fehérjék aminosav-szekvenciája, ha ez még nem ismert.
Egy rövid DNS-fragmens bázissorrendje gyorsan meghatározható
A komplex organizmus teljes genomjának szekvenálására való képességet 1986 előtt még nem vették figyelembe. A Nobel-díjas Renato Dulbecco és más tudósok azonban akkor azt javasolták, hogy világszerte mozgósítani kell a tudományos közösséget az egész emberi genom szekvenálásának kezelésére. Ennek egyik oka az volt, hogy azokat az embereket, akik a második világháború alatt túlélték Japánban az atombombát, és sugárzásnak voltak kitéve, meg kell vizsgálni DNS-károsodás szempontjából. Ahhoz azonban, hogy meg lehessen határozni az emberi genomban bekövetkezett változásokat, először ismerni kellett annak szekvenciáját.
Tehát közpénzből finanszírozták Emberi genom projekt elindult, egy hatalmas vállalkozás, amelyet 2003-ban - a vártnál jóval korábban - sikeresen befejeztek. Ezeket az erőfeszítéseket magánfinanszírozású csoportok támogatták és egészítették ki. A projekt számos új és úttörő módszer kifejlesztésében részesült, amelyeket először a kisebb genomok szekvenálására alkalmaztak - prokariótákból és egyszerűen felépített eukariótákból, például a modellorganizmusokból, amelyekkel a könyv előző fejezeteiben találkozott. Ezen módszerek közül sokat manapság széles körben alkalmaznak, köztük teljesen új módszereket, kifejezetten a genom szekvenálására. Az ágazat módszertani fejlesztése folyamatos. Ezeket a módszereket új módszerek egészítik ki a fehérjék és metabolikus termékek fenotípusos sokféleségének vizsgálatára egy sejtben. Alapvető követelmény volt és a számítógépes hardver és szoftver drámai továbbfejlesztése annak érdekében, hogy képes legyen megbirkózni a felmerülő hatalmas mennyiségű adattal.
Sok prokariótának egyetlen, míg az eukariótáknak sok kromoszómája van. Különböző méretük miatt a kromoszómák könnyen elválaszthatók egymástól. Úgy tűnik, hogy a legegyszerűbb módszer egy kromoszóma szekvenálásának megkezdése az egyik végén, és a teljes DNS-molekula egyszerű szekvenálása nukleotiddal nukleotiddal. A feladatot némileg leegyszerűsíti, hogy a két szálból csak az egyiket kell szekvenálni, mert a másik kiegészíti egymást. Nézd meg a sorrendet
akkor a másik szálnak így kell kinéznie:
Azonban a mai módszerekkel sem lehetséges, és nem is szükséges egy DNS-molekula szekvenálása, amely bázispárok milliói hosszúak az egyik végétől a másikig. Ezzel a stratégiával legfeljebb néhány ezer bázispár szekvenálható egyszerre. A genomszekvencia meghatározásához a kromoszóma több centiméteres DNS-szálát fel kell bontani sok rövid DNS-fragmensre, majd több ezer ilyen fragmenst szekvenálni egyszerre.
Az 1970-es években Frederick Sanger és munkatársai feltaláltak egy módszert, amellyel a DNS kémiailag módosított nukleotidok segítségével szekvenálható. Ezeket a nukleotidokat eredetileg arra tervezték, hogy megakadályozzák a rákos sejtek osztódását. Ezt a módszert (vagy annak egy változatát) alkalmazták az emberek és számos modellorganizmus első genomszekvenciájának meghatározására. A mai szabványok szerint azonban a módszer viszonylag lassú, drága és munkaigényes. Az új évezred első évtizedében gyorsabb és olcsóbb módszereket dolgoztak ki, amelyekre gyakran hivatkoznak Nagy teljesítményű szekvenálás összegzi. Ezek a módszerek egy eredetileg az elektronikai ipar számára kifejlesztett miniatürizált technikát és a DNS-replikáció mechanizmusait használják, gyakran a Polimeráz láncreakció (PCR).
Kereszthivatkozás
A PCR automatizálható; fontos módszer kis mennyiségű DNS szekvenálásához. A PCR-ről részleteket a 10.1007/978-3-662-58172-8_13 # Sec23 szakaszban talál.
A nagy áteresztőképességű szekvenálás módszerei, szintén összefoglalva a kifejezés alatt Következő generációs szekvenálás (NGS), gyorsan fejlesztik. A sokféle megközelítés egyikét itt vázoljuk és a 17.1. Ábra mutatja. Először a DNS-fragmenseket szekvenálásra készítjük el, szilárd hordozóhoz kötve és a DNS-t PCR-rel amplifikálva (17.1. Ábra a):
Egy nagy DNS-molekulát rövid, körülbelül 100 bp-os fragmentumokra bontanak. Ez fizikailag megtehető a DNS-t megtörő mechanikus nyíróerők létrehozásával. Vagy olyan enzimeket használnak, amelyek bizonyos időközönként hidrolizálják a DNS gerincében lévő nukleotidok közötti foszfodiészter kötéseket.
A DNS-t hő denaturálja, megszakítva a két szálat összetartó hidrogénkötéseket. Ezután minden egyes szál templátként szolgál az új, komplementer DNS szintéziséhez.
Rövid szintetikus oligonukleotidok kapcsolódnak az egyes fragmensek végéhez, és ezek szilárd hordozóhoz vannak rögzítve.
A DNS-fragmenseket PCR-rel amplifikáljuk. Olyan primereket használunk, amelyek komplementerek a szintetikus oligonukleotidokkal az egyes DNS-fragmensek végén. Mivel mindegyik pozícióhoz körülbelül 1000 DNS-másolat kapcsolódik, az újonnan hozzáadott nukleotidok könnyen detektálhatók a szekvenálási lépések során.