Ischaemiás stroke és ischaemia-reperfúzió kiváltása egerekben a középső artéria elzáródásával
Bevezetés
A szív- és érrendszeri betegségek, például a stroke vizsgálata in vivo modellek alkalmazásán alapul. Az iszkémia, a gyógyszer-toxicitás és/vagy a kezelés lehetséges hatásainak megértése érdekében szükség van a betegség megfelelő, szabványosított, megbízható és reprodukálható modelljének alkalmazására, amely lehetővé teszi a kezelési csoportok közötti összehasonlító vizsgálatokat. Ebben a kéziratban egereket használunk, mivel nagyszámú transzgenikus egér és standardizált értékelési modell áll rendelkezésre. A kísérleti ischaemiás stroke-ot követő és a gyógyulást követő motoros és viselkedési hiányosságok értékelésére rake-pontszámokat dolgoztunk ki 1, 2.
Számos ischaemiás stroke modell áll rendelkezésre, például teljes globális agyi ischaemia, hiányos globális ischaemia, multifokális agyi ischaemia és fokális agyi ischaemia. Ez utóbbi csoport a stroke kategóriája is a betegeknél a leggyakoribb. Az előesték többségét embolikus vagy trombotikus elzáródás képezi a középső agyi artérián vagy annak közelében (MCA). Ezen paraméterek hátterében a modell utánozza az emberi stroke betegség etiológiáját és rendkívül relevánssá teszi a kapott eredményeket. 3. Mindazonáltal a felfedezések lefordítása az állatmodellektől az emberek betegségeinek kezeléséig nehéznek bizonyult. Eddig csak a trombolitikus szöveti plazminogén aktivátor használatát engedélyezték akut ischaemiás stroke kezelésére 4.
Az egér fokális agyi iszkémiájának modelljei közül az agy hátsó keringési stroke modellje és az agyi vénák trombózisának modellje nagyon invazív, csökkenti alkalmazhatóságukat és korlátozza az elvégezhető elemzések körét. Azonban más technikák, mint például az embolikus modell, a fototrombózis modell, az endothelin-1 által kiváltott stroke modell és az intraluminalis varratközeg agyi artériák elzáródásának (MCAO) modellje, rendelkezésre állnak ilyen korlátozások nélkül. Az MCAO modell a protokollban leírt technika. Megbízható módszert biztosít a fokális agyi iszkémia kiváltására, amely könnyen reperfuzálható és nagy áteresztőképességű. Ennek a modellnek két megközelítése van, nevezetesen a Zea-Longa és a Koizumi módszer. Némileg különböznek egymástól abban, ahogy az elzáródási varrat bejut az érrendszerbe. A Zea Longa technikában a cérnát a külső carotis 5 artérián keresztül helyezzük be. Az itt bemutatott technikát módosítottuk a Koizumi-eljárásból, amelynek során az elzáró varratot a közös carotis 6 fölé helyezzük.
Az MCAO modellt sikeresen alkalmazták az iszkémiás stroke során bekövetkező különféle események értékelésére. Reperfúzió után agyi ödéma figyelhető meg a vér-agy gát lebontásával együtt. A csúcsideghalál általában 24 órán belül figyelhető meg; 7 nap múlva azonban visszatérhet a kezdeti szintre. Embernél a nem és az életkor fontos tényező a stroke eredményeinek meghatározásában, ezt megfigyelték 8, 9, 10 egereknél és patkányoknál is. akik a kezelés hatékonyságát használták 11, 12, 13, 14.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
Valamennyi eljárást a Miami Egyetemi Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság (IACUC) hagyta jóvá a Nemzeti Egészségügyi Intézet (NIH) irányelveivel összhangban. Steril berendezésekben és aszeptikus technikákra van szükség.
1. Készítse elő az elzáródási varratot
- Használjon 0,21 mm átmérőjű varratot 20-25 g közötti egereknél és 0,23 mm-t 25-35 g testtömegű egereknél. Az MCAO eljárás varrattípusának megválasztása az állat súlyán alapul.
- Ezüst tollal jelölje meg a varratot a szilikonnal bevont csúcstól 9 mm-re. Ez útmutatóként szolgál a telepítés hosszához.
2. Felkészülés a műtétre
3. A közös nyaki artéria és a belső/külső elágazás disszekciója
4. A CCA előkészítése az MCAO varrat behelyezéséhez
- Helyezzen három darab nejlonszálat kb. 4 hüvelyk hosszúra a CCA alá. Ügyeljen arra, hogy a CCA ne legyen megcsavarodva, mert ez drasztikusan megnehezítené a varrat behelyezését.
- A lehető legalacsonyabb ponton kösse az alsó varratot egy állandó csomóba.
- Kösse meg a felső varratot közvetlenül az ICA/ECA kereszteződés alatt egy kivehető csúszó csomóval.
- Kösse össze a középső varratot egy kivehető futócsomóval, de tartsa nyitva. Fontos, hogy hagyjon sok helyet, mert ez nem akadályozza meg a varrat behelyezését.
- Mikrodisszekciós rugós ollóval végezzen bemetszést a CCA-ban az alsó és a középső varrat között. Hajtsa végre a 0,2 mm-es bemetszést az alsó varrás közelében.
5. A középső agyi artéria elzáródása
6. Metszés bezárása és posztoperatív gondozás
- Ismét altassa az állatot (kövesse a 2.1. Pont utasításait), és távolítsa el a sebzáró varratokat.
- Csipeszek és szövetszeparátorok segítségével nyissa meg újra a metszést, és tegye ki a CCA-t.
- Óvatosan távolítsa el a felső varratot, és óvatosan húzza meg az MCAO varratot, amíg a szilikon bevonatú rész a csomó közepén van.
- Ismételje meg a fenti csomót a varraton, hogy megakadályozza a vér átfolyását a varraton (ennek nem kell csúszásnak lennie).
- Óvatosan lazítsa meg a középső csomót, és húzza a varratot a felső csomó mellett, de tartsa a CCA-n belül.
- Szorosan csukja be a felső csomópont artériát a véráramlás blokkolásához.
- Húzza meg teljesen az MCAO varratot, és szorosan zárja be a középső csomót.
- Az MCAO varrat többször felhasználható. Minden használat után óvatosan tisztítsa meg a varratot 70% -os etanolban, hogy steril gézzel távolítsa el a szennyeződéseket (pl. Vér vagy szövet). Ezt követően helyezze a varratot egy sterilizáló tasakba és sterilizálja.
- Ismételje meg a 6.1–6.4. Lépéseket, és ellenőrizze az állatok gyógyulását.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
A stroke térfogatának tanulmányozása mellett immunfluoreszcencia végezhető különféle célpontoknál, például mikrotubulusokkal társított protein-2 (MAP2) neuronkárosodás esetén (3A) vagy glia fibrilláris savas fehérje (GFAP) asztrogliózis esetén (3B). Az ilyen elemzések lehetővé teszik a stroke előrehaladásának és helyreállításának, valamint a stroke-szövet károsodásában és helyreállításában szerepet játszó egyéb folyamatok elemzését.
3 "src ="/fájlok/ftp_upload/54805/54805fig3.jpg "/>3. ábra: Az egér agyának stroke utáni immunfluoreszcens festése. 60 perces elzáródás után az agyakat 23 órán át gyűjtöttük, és feldolgoztuk reperfúziós kriovágás céljából. A MAP2 (felül) és a GFAP (alul) elleni antitestekkel a szövetet megvizsgálták az idegsejtes sérülések és az asztroglikózis szempontjából, akár álverés (bal oldali mezők), akár 90 perces ischaemia-reperfúziós agyak (jobb mezők). A bemutatott képek több képből készülnek, konfokális mikroszkóppal kombinálva, 10x objektív segítségével. A méretarány 1 mm. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
Asztal 1. Yardstick az egér megítéléséhez - Állapot és neurodeficit ischaemiás stroke után. 1-től 2-ig igazítva.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
A felhasználó tapasztalatától függően ez a módszer nagy áteresztőképességgel alkalmazható állatok nagy csoportjának vizsgálatára. Az állatkísérletek statisztikai szignifikanciája attól függ, hogy elegendő számú egyedet kell-e használni a kezelési csoportok között, annak ellenére, hogy felismerték a tesztállatok közötti belső különbségeket. A bemutatott protokoll lehetővé teszi az ilyen vizsgálatokat, miközben szorosan újrateremti a betegség egyes részeit.
Az MCAO technika előnye, hogy bár magában foglal néhány sebészeti beavatkozást, nem igényel túl invazív eljárásokat, mint a kraniotomia modellben. Ezenkívül nagyon jól reprodukálható, a reperfúzió pedig jól szabályozható, ami az endotelin-1 vagy az embolikus stroke modellekkel nem lehetséges. A technika utánozza az emberi iszkémiás stroke folyamatát, és az embereknél látható szövetekre jellemző sérüléseket okoz, ami a fototrombózis modell esetében nem áll fenn. Más közzétett technikákkal összehasonlítva az MCAO-eljárás nem igényli az ECA cauterizálását. Ez előny, mivel ICA infúziós modellünkkel kombinálva terápiás szereket juttathatunk el az érintett féltekére a stroke kiváltása után 23, 24, 25.
A szövetanalízis mellett az állatok viselkedését hosszan lehet nyomon követni a stroke súlyosságának és gyógyulásának értékelése érdekében. Ez segíthet a különböző kezelési csoportok közötti gyógyulás összehasonlításában. Számos megközelítést fejlesztettek ki a viselkedés értékelésére. Egyszerű, 5 pontos skálával értékelhető a stroke utáni neurológiai deficit (0: nincs viselkedési hiány; 1: nincs ellentétes mellső mellhosszabbítás; 2: köröz az infarktus másik oldalán; 3: csapdák az infarktus másik oldalán; 4: Alacsony tudatszint és spontán mozgás) 5. Ezenkívül az állat állapotának és viselkedésének mélyreható elemzése elvégezhető a gyógyulás 2 Asztal 1 1 leírt.
A bemutatott műtéti eljárás mechanikus eljárást alkalmaz a stroke kiváltására, amely a stroke-érzékenységre vonatkozó vizsgálatokban korlátozza e technika és/vagy kórokozók alkalmazását. Ez a protokoll azonban rendkívül hasznos lehet a stroke súlyosságának, elkerülési vagy korlátozási stratégiáinak, súlyosbító tényezőinek és a stroke utáni lehetséges terápiás megközelítések elemzésében. A kezelési csoportok összehasonlítása segíthet azonosítani azokat a lehetséges kezeléseket, amelyek minimalizálhatják a stroke károsodását vagy felgyorsíthatják a gyógyulást. Valóban nagy jelentősége lenne a stroke-ban szenvedőknek a gyógyulás javításában.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.