Kapcsolatok az oxidatív módon károsodott nukleotidok klaszterei és az aktív vagy nyitott nukleoszómák között

alanyok

absztrakt

Az olyan oxidatív károsodások megoszlását a bázisokhoz, mint a 8-hidroxi-guanin (8-OH-Gua), a nukleotidok felbontásának szintjén határoztuk meg, ligálás által közvetített PCR technikával. Ismert, hogy egy vese-karcinogén, a vas (III) -nitrilotriacetát (Fe-NTA) beadása oxidatív stresszt és az azt követő 8-OH-Gua képződést idéz elő a vesében. A teljes genomi DNS-t izoláltuk patkány veséből Fe-NTA kezeléssel vagy anélkül, majd megemésztettük formamidopirimidin DNS glikozilázzal (Fpg). Célul a thymin-glikol DNS-javító enzimjének, az Nth 1-nek a génjére összpontosítottunk. Hasított jeleket találtunk az 1. és a 3. exonban, de az 5. exonban nem. A sérült nukleotidokban dúsított nukleoszómák ezekben a régiókban rendkívül hozzáférhetőek voltak a mikrokokkusz nukleáz számára, különösen a vesében. Figyelembe véve az ezen régiók által kódolt fehérjeszegmens funkcióját, megvitattuk a sérült nukleotidok korlátozott képződésének molekuláris mechanizmusát.

bevezetés

A reaktív oxigénfajok (ROS) különféle típusú DNS-károsodásokat indukálnak, például egyszálú töréseket, kettősszálú töréseket, bázismodifikációkat, beleértve az apurin és az apirimid helyeket, és a DNS-fehérje térhálósítását (Dizdaroglu, 1991, 1992; Halliwell és Aruoma, 1991) A sejtgenomok oxidatív károsodásának szerepet játszanak a rákban és az öregedésben (Akman és mtsai, 1991; Basu és mtsai, 1989; Feig és mtsai, 1994; Loeb és mtsai, 1988; Maccabee és mtsai, 1994; McBride és mtsai, 1991; Moriya és mtsai, 1991; Tkeshelashvili és mtsai, 1991; Weitzman és Gordon, 1990; Wood és mtsai, 1990). A 8-hidroxi-guanin (8-OH-Gua) az oxidatív DNS károsodás egyik fő formája (Kasai és Nishimura, 1993; Umemura és mtsai., 1990), amely főleg GC → TA transzverziókat indukál Escherichia coli és emlős sejtekben (Cheng et al. 1992). A sejt-DNS 8-OH-Gua mennyiségének változásai HPLC-ECD-vel mérhetők (Floyd et al., 1986; Kasai, 1997). Az indukált DNS-károsodás és a mutációs spektrumok közötti kapcsolatot azonban nem tisztázták, mert a sérült nukleotidok DNS-ben történő in vivo kimutatására alkalmas eljárást még nem hoztak létre.

A közelmúltban a ligáció által közvetített PCR (LM-PCR) áttörést hozott a sérült nukleotidok kimutatásában a nukleotidok felbontásának szintjén (Denissenko et al., 1996). Az LM-PCR-t eredetileg genomi szekvenálásra fejlesztették ki, ideértve a CpG metilációs helyek kimutatását, valamint az in vivo lábnyomot is (Konishi és mtsai., 1995; Mueller és Wold, 1989, 1991; Nomoto és mtsai., 1995; Pfeifer és mtsai 1989). Azóta alkalmazzák nukleáz hasítási helyek, például mikrokokkusz nukleáz vagy DNáz I emésztés elemzésére, kromatin kutatás céljából (Kato és mtsai, 2000).

Az 1. és 2. exon által kódolt fehérjeszegmens egyedülálló az emlős Nth 1-nél, és mag- és mitokondoriális célzási jeleket, valamint feltételezhető interakciós helyeket tartalmaz más javító komponensek számára. A bifunkcionális enzimatikus aktivitásokért, a DNS glikoziláz aktivitásáért és az AP liáz aktivitásáért felelős fehérje szegmenst a 3–6. Exonok kódolják. Annak érdekében, hogy meghatározzuk a sérült nukleotidok korlátozott képződésének molekuláris mechanizmusát az 1–4. Exonban, elemeztük a máj, a vese és a lép kromatinszerkezetét kontroll patkányokban. Az Nth 1 gén 1–4. Exonjának nukleoszómái könnyen hozzáférhetők voltak az MNáz számára, különösen a vesében. Ez a megfigyelés jelezheti a vesekarcinogenezisre való hajlamot.

Eredmények

A sérült nukleotidok képződése az Nth 1 génben korlátozottan korlátozott

nukleotidok

A sérült nukleotidok eloszlása ​​az Nth 1 génben. ( a ) A piperidinnel hasított vagy Fpg-vel emésztett helyek eloszlását a vesék genomiális DNS-jén a Fe-NTA kezelés vagy a kontroll vesék kezelése nélkül meghatározott időn belül LM-PCR-rel elemeztük. A kontroll állatok veséiből származó genomi DNS-t DMS-sel is reagáltattuk, majd piperidinnel emésztettük és guanin (G) létraként alkalmaztuk. Az Nth 1 gén 1. exonjában a nem transzkribált szál hasítási profilját mutatjuk be. A "Txn" jelzi az előzetes transzkripció kezdő helyének helyzetét. ( ) Az Fpg által emésztett helyek megoszlása ​​a genomi DNS-en a fent leírtak szerint. Az Nth1 gén 3. exonjában a nem transzkribált szál hasítási profilját mutatjuk be. ( c ) Az Fpg által emésztett helyek megoszlása ​​látható az N-1 gén 5. exonjában lévő, nem transzkribált szálon.

kapcsolatok

Az Nth 1 gén sérült nukleotidjainak összefoglalása. Egér (M) és patkány (R) szekvenciákat hasonlítunk össze. Származtatott aminosavak láthatók fent (egér) és lent (patkány). Az egér és a patkány Nth-1 génszekvenciái közötti nukleotid divergenciákat fordított (töltött négyzet alakú) fekete betűk jelzik. A következtetett aminosav-helyettesítéseket fordított (töltött négyzet alakú) fekete betűkkel is jelezzük. A patkány Nth-1 génjének sérült nukleotidjai piros színnel vannak feltüntetve; A fordított (kitöltött négyzet alakú) piros betűk sérült nukleotidokat jeleznek, amelyeket az át nem írt szálon észleltek, míg a négyzet alakú piros betűk az átírt szálon észlelteket. Az 1. exonban az aláhúzás előzetes mitokondriális céljelet, míg a 2. exonban feltételezett mag lokalizációs jelet jelöl. A négyes Lys négyzet a 4. exonban a DNS glikoziláz aktivitásának aktív helyét jelöli, míg az Ason négyzet az 5. exonban az AP liáz aktivitásának aktív helyét jelöli.

A kromatin struktúrák szervezete az Nth 1 génben

kapcsolatok

A mikrokokus nukleázzal (MNáz) emésztett fragmensek etídium-bromid festése. A májból, a veséből és a lépből előállított kromatinokat MNázzal emésztettük az U

kapcsolatok

A mikrokokus nukleáz (MNáz) hasítási helyeinek elemzése az Nth 1 génben. A májból, a veséből és a lépből előállított mikrokokális nukleázzal emésztett DNS-fragmenseket a 3. ábra szerint LM-PCR-rel elemeztük. A "G-létra" felirattal ellátott sáv az 1. ábrán leírt guaninlétrát jelenti. A becsült nukleoszómafázis-helyzet a panel jobb oldalán látható. ( a ) A mikrokokusz nukleáz hasított helyeinek eloszlása ​​az Nth 1 gén 1. exonjában. A "Txn" jelzi az előzetes transzkripció kezdő helyének helyzetét. ( ) Az Nth 1 gén 3. exonjában levők megoszlása. ( c ) Az Nth 1 gén 5. exonjában levők megoszlása

vita

Az 1. és 2. exon által kódolt fehérjeszegmens egyedülálló az emlős Nth 1-nél, és úgy gondolják, hogy tartalmaz mag- és mitokondriális céljeleket és interakciós helyeket a javítórendszer egyéb komponensei számára (Ikeda et al., 1998). Nemrégiben Klungland et al. (1999) kimutatták, hogy az XPG fehérje az Nth 1 és az XPG közvetett interakcióján keresztül aktiválja az emberi és az S. pombe Nth 1-et, és stimulálja az Nth 1 fehérje kötődését a léziót tartalmazó DNS-hez. Nem figyeltek meg aktiválást vagy stimulációt XPG-vel az E. coli Nth 1 esetében. Ezért ezekben a régiókban a mutációk a mutált Nth 1 fehérje abnormális intracelluláris lokalizációját vagy rendellenességet eredményezhetnek.

Anyagok és metódusok

Állatok

Hat hetes hím Wistar patkányokat a Seiwa kísérleti állattól (Fukuoka, Japán) szereztünk be. Kereskedelemben kapható patkány-chow-val (Clea, Tokió, Japán) és csapvízzel látták el ad libitum, és 4 napos akklimatizáció után használták fel őket.

Vegyszerek és Fpg

A Fe (NO 3) 3, Na 2 NTA és a DNS Extractor WB Kit készletet a Wako Biochemicals-tól (Osaka, Japán) szereztük be. A piperidin és a dimetil-szulfát (DMS) a Nacalai Tesque cégtől (Kiotó, Japán) származik. A vas-nitriloacetát (Fe-NTA) oldatot közvetlenül az Awai és mtsai. (1979) kisebb módosítással. Röviden: Fe (NO 3) 3 és Na 2 NTA-t feloldunk Milli-Q vízben, majd 1: 4 mólarányban összekeverjük. A pH-t NaHC03-tal 7,4-re állítottuk. Az Fpg-t a Trevigen cégtől szereztük be (katalógusszám: 4040-100-01). A genomi DNS-t Fpg-vel emésztettük a gyártó utasításai szerint.

Fe-NTA kezelés

Összesen 30 állatot osztottunk Fe-NTA és kontroll csoportokra. A Fe-NTA csoportban 1, 6, 24, 72 és 120 órával a Fe-NTA (15 mg Fe/testtömeg-kg ip) beadása után megölték őket. A kontroll csoportban kezelés nélkül megölték őket. Minden alcsoport öt állatot tartalmazott. Az állatokat éteres érzéstelenítésben feláldoztuk. A veséket azonnal eltávolították, majd a kísérletekhez használták. A szerv egy részét lefagyasztották és -80 ° C-on tartották.

Ligáció által közvetített PCR (LM-PCR)

DNS-t extraháltunk a patkány veséiből (100-200 mg) a DNS extraháló WB kit alkalmazásával, Nakae és mtsai. (1995). A kivont DNS-t Fpg-vel emésztettük a fent leírtak szerint, vagy 1 M piperidinnel emésztettük 30 percig 90 ° C-on (Maxam és Gilbert, 1977). Az Fpg enzim felismeri az adeninből, guaninból vagy 8-OH-Gua-ból származó formamid-pirimidint, valamint néhány oxidált pirimidin-terméket, például az 5-hidroxi-citozint és az 5-hidroxi-uracilt (Tchou et al., 1994). Másrészt a piperidin kémiai reagens sokféle nukleotidszármazékot képes hasítani, beleértve a 8-OH-Gua-t és rokon vegyületeket (Chung et al., 1992), valamint különféle típusú származékokat, amelyeket Maxam és Gilbert kémiai reakciókkal állítottak elő. Kontroll guanin létraként a kontroll állatok genomi DNS-jének egy alikvot részét DMS-sel reagáltattuk és piperidinnel hasítottuk a fent leírtak szerint. Az LM-PCR-t a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (Konishi és mtsai., 1995; Nomoto és mtsai., 1995). Az LM-PCR-termékekből származó hasítási jelek nukleotidpozícióit a kontroll guaninlétráról és a patkány Nth-1 gén szekvencia-információiból határoztuk meg.

A patkány Nth-1 cDNS szekvencia-információi csak egy 3'-329 bp méretű fragmenst fednek le (GenBank H33255). Az LM-PCR primerek megtervezéséhez szükséges patkány Nth-1 génszekvenciáját az Nth-1 cDNS-ek közötti nukleotid szakaszokon alapuló primerekkel amplifikált patkány genomi PCR termékekből nyertük. egerekben és emberekben konzerváltak (Aspinwall et al., 1997; Hilbert et al. 1997). Az egyes LM-PCR primerek nukleotidszekvenciái a következők voltak. Az Nth 1 gén 1. exonjára: 1. primer, 5'-gcctggagctaaagttccacg-3 '; 2. alapozó, 5'-cccctgcaggcgcagcg-3 '; Primer 3, 5'-ccctgcaggcgcagcgctacCTGC (nagybetűvel jelöli az exon szekvenciáját). A 3. exon esetében: 1. primer, 5'-gtagtcagagatgcctgcctc-3 '; 2. alapozó, 5'-ctccagaacagtgccccctcttgg-3 '; 3. alapozó, 5'-ccagaacagtgccccctcttggttctgttgcc-3 '. 5. exon esetében: 1. primer, 5'-cagcaggatacctctcc-3 '; Primer 2, 5'-CaccaagctacactacCTGGGTAGCC-3 '; Primer 3, 5'-ccaagctacactacCTGGGTAGCCACTCTTCCAGG-3 '. Az 1. és 2. primert használtuk az első szál szintéziséhez, illetve a PCR amplifikációhoz. A 3 primereket az 5'-végén y-32 P-ATP-vel jelöltük, és a létra végső kimutatására használtuk.

Emésztés mikrokokus nukleázokkal

A kontroll patkányok májából, veséjéből és lépéből származó kromatin frakciókat a leírás szerint állítottuk elő (Gorsky és mtsai., 1986; Goldhamer és mtsai., 1995). Kromatin-szuszpenzió emésztési pufferben, 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,5 mM DTT, 0,15 mM spermidin, 0,34 mM szacharóz, 0,1 mM PMSF és 1 Az mM M CaCl2-t mikrokokusz nukleáz (Worthington Biochemical Corp.) soros hígításával emésztettük 20 ° C-on 5 percig. A fent leírt DNS-extrahálás után az MNázzal hasított helyek 5-végét T4 polinukleotid kinázzal és hideg ATP-vel foszforileztük (McPherson és mtsai., 1993; Truss és mtsai., 1995). A kivont DNS elektroforézisét 1,5% -os agarózgélen hajtottuk végre. A DNS-mintákat LM-PCR-nek vetettük alá a fent leírtak szerint.

hálaadás

Ezt a munkát a japán Oktatási, Kulturális, Sport-, Tudományos és Technológiai Minisztérium és a Fukuoka Cancer Society (Fukuoka, Japán) rákkutatási támogatásai támogatták.