Laboratóriumi folyóirat - Termékáttekintés - Antitest tisztító készletek
A tudományos kutatólaboratóriumokban az antitesteket gyakran affinitásoszlopok segítségével tisztítják. Fotó: Floridai Egyetem
(20.09.20.) Az antitest-tisztító készletek többnyire kis forgóoszlopokon vagy gyöngyökön alapulnak, amelyek A vagy G fehérjével vannak ellátva. Egy izraeli csoport érdekes kromatográfia nélküli alternatívát dolgozott ki.
Mi lenne a modern élettudományi kutatás poliklonális (pAb) vagy monoklonális antitestek (mAb) nélkül? Nem maradna túl sok belőle, ha figyelmen kívül hagyja a mindenütt jelenlévő PCR-t. Alig van olyan kísérlet vagy vizsgálat, amelyben a kis segítők nem vesznek részt, és megkönnyítik a kutatók életét, vagy eleve lehetővé teszik kísérleteiket. Az antitestek nemcsak az alapkutatásban nélkülözhetetlenek számtalan módszer és protokoll esetében, az immunvizsgálatoktól, a Western blotoktól, az ELISA-któl és az immunhisztokémiától kezdve a mikroszkópián és képalkotáson át az áramlási citometriáig. Fontos eszközei a klinikai diagnosztikának is, és egyre inkább aktív összetevőként vagy terápiás ellenanyagként használják őket különféle betegségek kezelésére.
A poliklonális antitestek vagy az immunglobulinok (Ig) egyik legfontosabb forrása az emlősök vérplazmája. A tömeg alapján a benne lévő fehérjék körülbelül húsz százaléka antitest, amelyek öt különböző osztályba sorolhatók: IgA, IgD, IgE, IgG és IgM. Az első három fontos szerepet játszik az immunrendszeren belül is, de az IgG-ket és az IgM-eket leginkább kutatási célokra használják. Az IgM-ek az antigénnel szembeni elsődleges immunválasz korai szakaszában jelennek meg, míg az ezt követő másodlagos immunválaszban az IgG-k nagy mennyiségben szintetizálódnak.
A kutatók ezt kihasználják azzal, hogy nyulakat, kecskéket, juhokat vagy más emlősöket injektálnak antigénnel, majd általában izolálják és megtisztítják az immunválasz során képződött IgG-ket az állatok plazmájától vagy antiszérumától. A pre-kit korban először ammónium-szulfáttal kicsapták a plazmafehérjéket, amelyet 25% -os végkoncentrációig adtak hozzá. Centrifugálás és a fehérjék eltávolítása után az IgG-k került sorra, amelyeket ötven százalék ammónium-szulfáttal csaptak le.
Az ammónium-szulfáttól való megszabadulás érdekében kapott ellenanyag-oldat két kicsapási lépése és az azt követő dialízise azonban sok kézi munkát igényel, és több napig tart. Az IgG-k sokkal gyorsabban és könnyebben izolálhatók antitest-tisztító készletekkel, amelyek szinte teljes egészében kis affinitás-oszlopokon vagy gyöngyökön alapulnak, amelyek A-fehérjével vagy G-fehérjével vannak ellátva. Eredetileg a Staphylococcus aureus (A-fehérje) és a Streptococcus sp. A (Protein G) eredetű felületi fehérjék nagy specifitással kötődnek sok IgG Fc részéhez.
Míg a G fehérje nagy affinitással rendelkezik a legtöbb IgG-hez, az A fehérje valamivel válogatóbb, és alig vonzza például a hörcsögök, patkányok vagy juhok IgG-i. Az affinitás-tisztításhoz az A és G fehérje rekombinánsan expresszált variánsait külön-külön vagy néha kombinálva, vagy a mágneses gyöngyök felületi anyagához kötjük a kromatográfiás gyantákhoz. Gyakran egyetlen kromatográfiás lépés elegendő az izolált antitestek 98% -nál nagyobb tisztaságának eléréséhez.
A kutatólaboratóriumokban a lényegesen instabilabb, aggregálódni hajlamos IgM-eket gyakran affinitásoszlopokkal tisztítják. Az itt használt kötő mátrix nem fehérje A vagy G, hanem mannózkötő fehérje vagy mannózkötő lektin (MBL), amelyet többnyire agarózon rögzítenek.
Nagyobb léptékű tisztításhoz a protein A és G vagy más affinitáskromatográfiás specifikus ligandumok meglehetősen drágák. Az antitestgyártók és a laboratóriumi laboratóriumok ezért többnyire áttérnek a klasszikus ioncserélő kromatográfiára, és az oszlopokat például sokkal olcsóbb anioncserélőkkel, például dietilaminoetil (DEAE) agarózzal töltik meg, hogy tiszta IgG-ket, IgM-eket és különösen monoklonális antitesteket (mAb) kapjanak. De még ezeknek a technikáknak is küzdeniük kell a kromatográfiai tisztítási módszerek általános hátrányaival - például korlátozott kötési kapacitással, magas időveszteséggel és az eszközök költséges karbantartásával.
Egyes csoportok ezért kitartóan dolgoznak a kromatográfiai folyamatok alternatíváin, az egyre gyakrabban hallható szlogenet követve: Minden, csak nincs kromatográfia (Bármi, csak a kromatográfia, ABC). Az antitestek egyik ilyen kromatográfiás tisztítási koncepciójának egyikét Guy Patchornik csoportja az izraeli Ariel Egyetemről mutatta be tavaly az indiai kollégákkal együtt (MABS 11 (3): 583-92). Mivel az antitesteket hidrofób kölcsönhatás-kromatográfiával (HIC) is meg lehet tisztítani, Patchornik feltételezte, hogy az antitestek láthatóan egy kicsit erősebben kötődnek a hidrofób gyantákhoz, mint más vízoldható fehérjék. Tehát elképzelése szerint hidrofób detergens aggregátumokkal is meg kellene ragadni őket.
A Patchornik alkalmazottai úgy állították elő az aggregátumokat, hogy először a hidrofób kelátképző fürdő-fenantrolint (Batho) adták a vizes Tween-20 oldathoz, és az elegyet vortexelték. Ez Tween 20 micellát kapott, amelyek felületét a Batho-molekulák hidrofób része díszítette. Ezután ezeket a megmunkált micellákat összekeverték egy vas-szulfát-oldattal, majd újra vortexeltek. A további reakció ezután gyakorlatilag automatikusan folyt: A Fe 2+ ionok hidrofób (Batho) 3: Fe 2+ komplexeket képeznek a micellák és a víz közötti fázishatáron elhelyezkedő Batho molekulákkal, amelyek a micellák térhálósodásához vezetnek, így hidrofób Tween keletkezik. -20 egység vezet.
Az izraeliek mesterséges szennyezésként E. coli-lizátumot tartalmazó poliklonális humán IgG-k keverékével tesztelték, hogy az aggregátumok alkalmasak-e antitestek tisztítására. Az általuk alkalmazott tisztítási eljárás nagyon egyszerű: az antitest keveréket öt percig inkubáljuk az előre elkészített Tween-20 aggregátumokkal, majd két percig centrifugáljuk. Az IgG-ket ezután néhány perc alatt izolálhatjuk az aggregátumokból 50 millimólos izoleucin-oldattal (pH 3,8). Az egész szérummentes hibridóma táptalajban is működik, amelyet általában monoklonális antitestek előállítására használnak - valamint szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) jelenlétében, amelyet az antitest előállításához a sejttenyésztő táptalajokban is gyakran találnak.
Mivel a Tween-20 aggregátumokkal izolált IgG-k tisztasága és a hozam is csak valamivel rosszabb, mint a protein A affinitáskromatográfiával, Patchornik meg van győződve arról, hogy módszere a hagyományos tisztítás valódi alternatívája. Még azt is elképzelheti, hogy a terápiás antitestek tisztításakor az A-fehérje oszlopokat helyettesíti.
Ana Cecília A. Roques a lisszaboni Universidade Nova csoportjában megkerüli a kromatográfiás antitesttisztítást affinitás-ligandum, kicsapás és mágneses nanorészecskék kombinációjával (Biotechnol. J. DOI: 10.1002/biot.202000151).
A három egyedi technika természetesen nem új keletű. Újdonság azonban az, hogy összeolvadnak az úgynevezett Affinity mágneses csapadék képződésével. Alapvetően ez rendkívül egyszerű - a legbonyolultabb lépés a mágneses nanorészecskék előállítása, amelyek triazin ligandummal vannak felszerelve, amely specifikusan kötődik az antitestekhez.
A részecskéket ezután 20% PEG3350-gyel keverjük, amely kicsapószerként szolgál. A nyers extraktumot egy órán át inkubáljuk 4 ° C-on, majd orbitális rázógépen rázzuk. Ezután tizenöt percig mágneses teret alkalmazunk annak érdekében, hogy a kicsapódott mágneses részecskéket elválasszuk a felülúszótól a hozzájuk tapadó antitestekkel. Az antitesteket ezután semleges PBS-oldattal óvatosan eltávolítják a nanorészecskékből.
E módszer alkalmazásával Roque csapata 50 százalékos hozammal és nyolcvan százalékos tisztasággal izolált poliklonális antitesteket az emberi szérumból. A portugálok még jobb értékeket értek el a monoklonális antitestek tisztításánál.
(Első kiadvány: H. Zähringer, Lab folyóirat 2020/2020, minden információ garancia nélkül)
Utolsó változtatások: 2020.01.09
© 1996-2020 Szerkesztői tartalom: LJ-Verlag GmbH & Co. KG, Freiburg, tervezés és programozás: f + r internetes ügynökség, Freiburg,
Képek és grafikák - hacsak másként nem jelezzük - a megfelelő szerzőkkel és fotósokkal.