Laborjournal online Journalclub - víz a módja
Karin Hollricher
Marburg: A vízmolekulák döntő fontosságúak a fehérjék és a ligandumok közötti kötésekben. Ezért vegyészek és gyógyszerészek nagyon alaposan szemügyre veszik őket.
Neutron-kristályográfia, kalorimetria, entalpia, entrópia - ezek azok a jelszavak, amelyek szó szerint az olvasóra jutnak Johannes Schiebel és munkatársai, a marburgi Philipps Egyetem cikkéből (Nat. Commun. 9: 3559). Azonnal utaló szavak: Itt bonyolódik. "A cikkeinket szinte mindig nagyon nehéz elolvasni" - mondja Gerhard Klebe vezető szerző, aki a Marburgi Egyetem Gyógyszerészeti Kémiai Intézetében kutat. "De ha átharapsz, akkor tényleg kapsz belőle valamit." Rendben, elfogadjuk a meghívást.
Klebe és munkatársai a Drug Design munkacsoportban szeretnék optimalizálni a hatóanyagokat - és nem csak tegnap óta. Klebe szakmai karrierjében nagyjából minden a gyógyszeres hatások oktatása és fejlesztése körül forog: kémia szakon tanult, egy évig a grenoble-i neutronforrásnál, a kristálytan posztdoktorainál, több mint tíz évig a BASF-nél, 1996 óta a Marburgi Egyetemen, és a nagyon dicsért tankönyv szerzőjéig. " Hatóanyag-tervezés ".
A fehérjéknek vízmolekulákat is el kell távolítaniuk az útból a ligandumok megkötése érdekében. Fotó: iStock/cactuseskimo
Munkacsoportjának legfrissebb publikációja a fehérjék és a ligandumok, pontosabban az enzimek és inhibitorok közötti kapcsolatok komplex összefüggéseivel is foglalkozik. A kísérletek bonyolultak - ezért a kutatók kerestek egy „egyszerű” fehérjét: a tripszint. Ez az enzim a szerin proteázok osztályába tartozik, és gátolható N-amidinopiperidinnel és benzamidinnal.
A gyógyszerészek és a vegyészek szerint a víz többek között meghatározza, hogy két molekula tökéletesen illeszkedik-e egymáshoz, mint egy kulcs és zár. Mivel a sejtfehérjék vizes oldatban működnek, és ennek megfelelően erősen hidratáltak, intuitív módon nyilvánvaló, hogy a megkötni akaró ligandumnak előbb teret kell teremtenie és néhány vízmolekulát meg kell mozgatnia. Ez a tézis azonban kísérletileg még nem bizonyított alaposan. Legalább a megerősítést a trombin enzim szolgáltatta, amely szintén a véralvadás szempontjából fontos szerin-proteáz. Miután az egyes vízmolekulákat eltávolították a trombin megkötő zsebéből, az inhibitorok kötési viselkedése drámaian javult. Ez a felfedezés hatékonyabb antikoagulánsok kifejlesztéséhez vezetett.
"Mindaddig, amíg nem tudjuk, hol vannak a vízmolekulák és hogyan változik a helyzetük, a fehérjék és kötő partnereik közötti kölcsönhatásról szóló ismereteink hiányosak maradnak" - magyarázza Klebe. "A módszereket a határokig kellett alkalmaznunk ahhoz, hogy leírjuk a vízmolekulák viselkedését a tripszinnel." És ezzel a Marburg csapata és genovai, jülichi, hamburgi és müncheni munkatársai 15 oldalt töltöttek meg - plusz egy kiegészítést.!
A kötési vizsgálat termodinamikai elemzésekkel kezdődött. Még ha régóta ismert is, hogy a termodinamikai tényezők döntően befolyásolják a kötődési viselkedést, ezeket csak keveset tanulmányozták. Túl bonyolult. A termodinamikai folyamat leírására használt képlet, amikor két molekula kötődik, nagyon egyszerűnek tűnik: ∆G ° = ∆H ° - T∆S °.
∆G, a szabad és kötött állapot közötti Gibbs-energia különbsége határozza meg a reakciót. Ezt a különbséget az entalpia H ° és az S ° entrópia közötti különbség alkotja. Az entalpia a rendszerben állandó nyomáson található összes energia. Az entrópia a rend rendjét írja le. A termodinamika második törvénye szerint a reakció önként megy végbe, amikor ∆S nulla felé fordul, azaz G a reakció miatt kisebb lesz.
Mit jelent ez a fehérjék és a ligandumok szempontjából? Az erős kötés mindig társul egy kis Gibbs-energiához, a szabad és kötött molekulák közötti ∆G különbség ekkor egyértelműen negatív. Ez az energia különbség hőátadásként bizonyítható izoterm titrációs kalorimetriával (ITC). A kötőpartnereket állandó hőmérsékleten titráljuk, és a komplex kialakulásakor keletkező hőmennyiséget kaloriméterrel mérjük. Ma a kaloriméterek annyira érzékenyek, hogy felhasználhatók a mikrokalóriák nagyságrendű hőmennyiségének detektálására. A hőmérés egyszerű kísérlet, és az eszközszoftver megbízhatóan leadja a ∆H ° -ot, a kötési állandót és ezáltal a Gibbs-energiát is. De ez még nem minden. A kemény dió az értékelés: mely atomok vagy kötések melyik energia-változáshoz járulnak hozzá?
Ha egy ligandum kiszorít egy erősen rögzített vízmolekulát, és új hidrofób kölcsönhatások lépnek fel, az entrópia nyeresége nagyobb, mintha egy kevésbé szilárdan kötött vízmolekulának kellene utat engednie. "Sajnos azonban az entalpia és az entrópia gyakran egymás ellen hatnak" - magyarázza Klebe. A kötés optimalizálása érdekében ezért nem elegendő egy ligandumot úgy módosítani, hogy csak az entrópia csökkenjen. "Figyelembe kell venni az entrópia és az entalpia közötti különbségek változását."
Marburgban Tobias Wulsdorf, a számítástechnika terén jártas vegyész valóban elengedte a gőzt a tripszin inhibitor kötés termodinamikai képletrendszerében. Kimutatta, hogy a benzamidin erősebb kötése a piperidin inhibitorhoz képest entalpiailag előnyös.
A vízmolekulák szerepének szemléltetésére a szerzők meghatározták a kristályszerkezeteket. Erre általában röntgensugarakat használnak. Klebe szerint azonban ez nem elég érzékeny a vízmolekulák pontos lokalizálására. Ezért használták a müncheni Műszaki Egyetem neutronforrásának sugárzását. Nagyon nagy fehérjekristályokra van szükség a neutron kristályográfiához. Ezek elkészítése művészet. „Aranyujjakkal” lelkesedik Klebe, Johannes Schiebel első szerző, majd posztdoktori hallgató tripszinkristályokat alkotott - ligandumokkal és anélkül. Klebe: „A neutrondiffrakcióban az a nagyszerű, hogy a sugárzás nem rombolja le a fehérjekristályokat, és a méréseket meg lehet szakítani, majd folytatni lehet. Tehát hetekig tudtunk mérni egy kristályon - megszakításokkal -, és így 1,5 angströmp alatti felbontást tudtunk elérni. Ezek a legjobban feloldott neutronszerkezetek, amelyeket eddig ilyen méretű fehérjéken végeztek. "
Tudjon meg többet új termékeinkről, és rendelje meg még ma az új 2021-es katalógust a címen. több
De ez még nem minden: a vegyészek meghatározták a röntgen kristályszerkezeteket is. A nagy kihívás az volt, hogy szobahőmérsékleten végezzük a röntgen méréseket, például a neutron-diffrakciót, hogy az adatokat utána össze lehessen hasonlítani és kombinálni. Klebe: "Számíthatunk egy kombinált X-N struktúrára (a szerkesztő megjegyzése: X jelentése X-Ray, N a neutronok) a röntgen- és neutronadatokból, és a termodinamikai adatokkal együtt felhasználhattuk számítógépes szimulációkhoz."
A csapat kilenc vízmolekulát talált az aszpartát 189 körül a tripszin kötő zsebében. Három közvetlenül a tripszin megkötő zsebében található, négy további többé-kevésbé az aszpartát mögött van, és „tartályként” szolgál, ha valamelyik belső molekula elveszik. Ami könnyen megtörténhet, mert a belső vízmolekulák nincsenek olyan szorosan kötve csak két hidrogénkötéssel, mint a külső három. A többi kicsit távolabb van.
A marburgi kutatók kimutatták, hogy egy inhibitor megkötésekor kiszorítja a vízmolekulákat. Ennek eredményeként megváltozik egy másik vízmolekula orientációja: Megközelíti a 228 tirozint, új hidrogénkötést hozva létre. Ennek eredményeként szilárdabban rögzítve van, és már nem tud szabadon forogni, ami „entrópiás büntetést” eredményez, ahogy a szerzők írják. Ezek és sok más nagyon részletes megfigyelés megmutatta, mely hidrogénkötéseket és hidrofób kölcsönhatásokat szakítja meg a komplex képződés, és melyeket újonnan alakítják ki. Klebe: "Úgy gondoljuk, hogy a fehérje vízszerkezete és az aszpartát töltöttségi állapota felelős a két inhibitor tripszinhez való kötődési affinitásáért."
A Klebe által az évek során az egyetemeken és az iparban megszerzett tapasztalatokat a jövőben nem szabad kizárólag papíron felhasználni. Márciusban az ex-Klebe munkatársai támogatásával megalapították a CrystalsFirst vállalatot. A cél egy új, „SmartSoak” néven ismert technológia alkalmazása a fehérjekristályok stabilizálására, 3D-s szerkezetük meghatározására és ezáltal a gyógyszeres jelöltek begyűjtésére szoftver segítségével. "Ily módon a modern gyógyszerészeti kutatáshoz elengedhetetlen geometriai adatok gyorsan és mindenekelőtt megbízhatóan eljuttathatók a kábítószer-keresés nagyon korai szakaszában, és a drogkereséssel járó nagy erőfeszítés jelentősen csökken" - áll az alapító cég sajtóközleményében. Lássuk, valóra válik-e.
Gerhard Klebe (hátsó, nyitott kabát) vegyész (hiányos) munkacsoportja szeret felfedező körútra indulni: Különösen kedvelik a kristályokat - akár barlangokban, akár fehérjékkel. Fotó: AG Klebe