Szövettani festési technikák, mint az élelmiszer-elemzés eszközei Lehetőségek és korlátok
1 workshop az élelmiszer-szövettanról/56. workshop az élelmiszer-higiéniáról GAP A hisztológiai festési technikák, mint az élelmiszer-ellenőrzés eszközei Lehetőségek és korlátok Kapcsolattartó személy: Alexandra Bartholomä Tanácsadás és értékelés Tel .: +49 (2151) Fax: +49 (2151) Vegyészeti és Állategészségügyi Nyomozó Iroda Rhein-Ruhr-Wupper AöR, 1. oldal Deutscher Ring 100, Krefeld Internet:
2 Rutin módszerek az élelmiszerek szövettani vizsgálatára A vizsgálati módszerek hivatalos összegyűjtése (ASU) a 35 LMBG L szerint (1989. dec.) A hús, húskészítmények és kolbásztermékek szöveti összetételének meghatározása Rutin módszerek a kvalitatív és kvantitatív szövettani vizsgálatra. megértette a levágott vagy leölt melegvérű állatok feldolgozott részeinek összegét. Növényi eredetű azonosítható sejtek is felvehetők a lényeges természetre vonatkozó megállapításokba. 2. oldal
3 festési módszer az ASU L 3. oldalának megfelelően
4 További festési módszerek 4. oldal
5 Calleja festés elve: pikroindigókarminnal plazmafestésként a különféle szöveti komponensek eltérően festődnek; a magfestést gyorsan gyorsan vörös színnel végezzük. Értékelés: Sejtmagok: vörösesbarna (intenzív magfestés nehezen elérhető) Izmok felforrósodtak: világoszöld, nem fűtött: erős zöldtől sötétzöldig terjedő nagy parenchima, egyéb szövetek: (világos) zöld kollagén kötőszövet fűtött: halványkék, nem fűtött: kék rugalmas kötőszövet: sárga porc, csontok: kék 5. oldal
6 Calleja-Lugol festés = Calleja festés és Lugol festés kombinációja Használat szénhidrátokat tartalmazó termékekben (pl. Húsgombóc) Használat olyan mintákban, amelyek makroszkopikusan pozitívak Lugol elvére: Ezen kívül szénhidrátokat (különösen natív keményítőt) észlelnek a Lugolban Az oldatban található jód a szénhidrátok spirálspirálaiban lerakódik és kék és fekete színben jeleníti meg őket, hogy megkülönböztessék a keményítőt és a hasonló szerkezetű szénhidrátokat, amelyek -1,4-kötéssel kapcsolódnak más szénhidrátokhoz, amilázkezelés (0, 5% amiláz-oldat foszfátpufferben 2 órán át) (történelmileg: nyálminta) az amilázkezelés a keményítő szilárdságának ellenőrzésére szolgál a keményítőtartalmú amilázzal kezelt párhuzamos szakaszokban, a kék-fekete vastagság által korábban lefedett struktúrák értékelhetők 6. oldal
7 Calleja (Lugol) festés Értékelés: a szerveket és szöveteket a Calleja festéshez hasonlóan mutatjuk be, emellett a - hélixekkel rendelkező szénhidrátok barnától feketéig színeződnek. vagy nem láthatók a 7. oldalon
8 Calleja (Lugol) festési lehetőség: áttekintés és differenciálfestés! mennyiségi értékelés további szövetek/szervek (nem máj!) további vizsgálatával, a váz-, szív- és nyelvizmok (beleértve az aprítás mértékét) kötőszövet (kollagén/elasztikus kötőszövet) csontszövet, porcszövet, erek mennyiségének lehetséges azonosítása és (félig) mennyiségi meghatározása, Mirigyszövet, nyirokszövet, idegszövet, bőr nyálkahártya máj, vese, tüdő és egyéb belsőségek által újrafeldolgozott kolbászhús tokkal vagy anélkül (hamis negatív eredmények lehetségesek) növényi összetevők (pl. Fűszerek, szarvasgombák) a növényi sejtcsoportok védelme polarizációs mikroszkóppal 8. oldal
9 Calleja (Lugol) festési lehetőségek: Nem hús adalékanyagok jelenlétének jelzése Nyers és melegített anyagok megkülönböztetése Keményítő és analóg szénhidrátok kimutatása -1,4-kötéssel (csak Calleja-Lugol festés) Szénhidrátok jelenlétének jelzése a Calleja-Lugol festés, ha a struktúrák foltosak maradnak az amilázkezelés után, 9. oldal
10 Calleja (Lugol) festési határértékek: a hevítés mértékétől függően a sejtmagok néha nem jelennek meg optimálisan. A Calleja-festésnél a szénhidrátok nincsenek kiemelve. A Calleja-Lugol festéssel a KH kimutatása a KH molekula bizonyos szerkezetéhez kapcsolódik 10. oldal
11 Calleja (Lugol) színű nyelvkolbász 25x 11. oldal
12 Calleja (Lugol) színező nyelvkolbász 100x 12. oldal
13 Calleja (Lugol) főtt kolbász festése 25x 13. oldal
14 Calleja (Lugol) főtt kolbász színezése 100x 14. oldal
15 Calleja (Lugol) főtt kolbász színezése 25x 15. oldal
16 Calleja (Lugol) főtt kolbász színezése 100x 16. oldal
17 Calleja (Lugol) nyers kolbász színezése 25x 17. oldal
18 Calleja (Lugol) színező nyers kolbász 100x 18. oldal
19 Calleja (Lugol) főtt szalámit színező 100x 19. oldal
20 Calleja (Lugol) főtt szalámi színezése 100x 20. oldal
21 Calleja (Lugol) vörös kolbász színezése 25x 21. oldal
22 Calleja (Lugol) főtt kolbász színezése 100x 22. oldal
23 Calleja (Lugol) főtt kolbász színezése 100x 23. oldal
24 Calleja (Lugol) színező baromfihús kolbász 100x 24. oldal
25 Calleja (Lugol) májkolbász színezése 25x 25. oldal
26 Calleja (Lugol) főtt kolbász színezése 25x 26. oldal
27 Calleja (Lugol) főtt kolbász színezése 100x 27. oldal
28 Calleja (Lugol) főtt kolbász színezése (Wiener) 100x 28. oldal
Calleja (Lugol) főtt kolbász színezése (Wiener) 100x 29. oldal
30 Haematoxilin-eozin (HE) festés Áttekintés a festésről, amelyet gyakran hemalum-eozin festésnek neveznek. Alapelv: A szervi struktúrák megkülönböztethetők, ha a sejtmagokat haematoxilinnel, a citoplazmát pedig eozinnal festjük. Értékelés: Sejtmagok: kék-ibolya Citoplazma: rózsaszínű 30. oldal
Haematoxilin-eozin (HE) festési lehetőségek: A Calleja festéssel gyanús megállapítások (pl. Szív, máj, vese, tüdő, bőr nyálkahártya, baromfi bőr, kéreg bizonyítékai) igazolhatók, mert a sejtmagok és a citoplazma ellentétesek. Határértékek: összehasonlításban A Calleja festésnél a kötőszövetet és az izmokat nehezebb megkülönböztetni és számszerűsíteni a színkontrasztok hiánya miatt. A szénhidrátok nincsenek kiemelve. A Calleja festéssel párhuzamos rutinszerű használat nem szükséges. 31. oldal
A májkolbász haematoxilin-eozin (HE) festése 100x 32. oldal
33 Ezüst-nitrát impregnálás a Kossa differenciálfestés szerint a csontszövet kimutatására Alapelv: a karbonátokban és a foszfátokban lévő megkötött kalciumot ezüst-ionokra cserélik pirogallol és kálium-permanganát hozzáadásával, az ezüstvegyület fém ezüstre redukálódik, jelentős kalciumkoncentrációk csak a csontokban kötődnek, más Az oldható kalciumionokat a szakaszok előkezelése során mossák ki. Értékelés: Csontrészecskék: fekete Citoplazma: vörös-barna Sejtmagok: piros 33. oldal
34 Ezüst-nitrát impregnálás Kossa főtt kolbász szerint 100x 34. oldal
35 Trichromfestés Pfeiffer, Wellhäuser és Gehra szerint - Alizarin S-festés Differenciálfestés az mineralizált csontrészecskék minőségi és mennyiségi kimutatásához Alapelv: Az mineralizált csont kalciumtartalmú csontanyagot (hidroxi-apatit) jelent, amelynek pH-ja 4,3-4,5 a csont kalciuma (és más kétértékű kationok (Mg, Al) is) és az alizarin S élénk sárga-vörös kelát vegyület (színes lakk) védelem (az ASU-ban nem írták le): egy szakasz további színezése, amelyet korábban ugyanattól az anyagtól 5% salétromsavval meszeltek le A vízkőmentesített szakaszban, a morfológia megőrzésével, a csontrészecskék a szövet többi részének kék színét veszik fel, mert a kalcium feloldódott. Csontrészecskék számlálása (az ASU-ban nem írták le): 10 metszetet vagy kb. 40 cm²-t vizsgálunk kvantitatív számlálás céljából (Bijker et al., 1984 ) 35. oldal
36 Trichrom festés Pfeiffer, Wellhäuser és Gehra szerint - Alizarin S festés Értékelés: Csontok: piros Porc: kék Izmok és kötőszövet: kék Eredmény salétromsavval történő kezelés után: Izmok, kötőszövet, demineralizált csontok: kék Barlang: A csont részecskék eltávolítása a készítmények elkészítése során, pl. A vágás során nagyon nagy csontrészecskék tolhatók ki a vágásból, a vágás során rés marad látható A csontrészecskék demineralizálása (pl. Hosszabb formalin tárolás révén) A csonttartalmat ezért nem lehet túlbecsülni, inkább lebecsülni 36. oldal
37 Trichrom festés Pfeiffer, Wellhäuser és Gehra szerint - Alizarin S festés baromfikolbász 25x 37. oldal
Trichrom festés Pfeiffer, Wellhäuser és Gehra szerint - Alizarin S festés baromfikolbász 100x 38. oldal
39 Trichrom festés Charvat differenciálfestéssel az újrafeldolgozott forrázott kolbász kimutatására Alapelv: a festés detektálja a füstrészecskéket (a burkolatban és az alatta levő kolbászhúsban). A szín a dohányzás után megváltozott kolbász felületét és a hozzá közvetlenül csatlakozó szövetet mutatja. Értékelés: A füstölt kolbász részei: narancsvörös A készítmény további részei: az újrafeldolgozott kolbász szürkészöld részecskéi a kétszeres melegítés miatt általában jobban tömörülnek, és nem teljesen integrálódnak a kolbászhúsba, minél jobban aprítják az újrafeldolgozott anyagot, annál nehezebb észlelni a 39. oldalt
40 Trichrom színezés a Charvat szerint. Lehetőségek: A dohányzás intenzitásától függően μm széles narancs-vörös réteg jelenik meg. A dohányzás bizonyítéka a burkolat (hámló bőr) eltávolítása után is elvégezhető. Határok: nem füstölt természetes bőr (főtt kolbász, curry kolbász) nem mutatható ki Nagyobb vastagsága és a Grocott színben (fekete) vagy az áteresztett fény polarizációjában (spektrális színek) meglévő zárványai miatt az újrahasznosított főtt kolbászrészecskék a tömörített szerkezet és az intenzívebb zöld szín miatt a Calleja vagy a Calleja-Lugol színben is felismerhetők! 40. oldal
Trichrom színezés Charvat főtt kolbász szerint 100x 41. oldal
Trichrom színezés Charvat főtt kolbász szerint 200x 42. oldal
Calleja Lugol főtt kolbász festése 25x 43. oldal
44 Grokott festés Differenciálfestés Az ezüst impregnálással 1,2 diolcsoportot tartalmazó szénhidrátokat detektálunk pl. A sűrítőkben, a növényi fehérje készítményekben és a természetes belekben a növényi fehérje készítmények a sejtfal komponenseinek maradványait (szénhidrátokat) tartalmazzák, amelyek a Grokott színeződés következtében a fehérje részecskékben zárványként jelennek meg. Alapelv: a Grokott szerinti ezüst impregnálással a szomszédos szénatomokon két hidroxilcsoporttal detektáljuk a poliszacharidokat (1,2-diol-csoportok) ezek pl. keményítőben, guarlisztben, szentjánoskenyérlisztben, agarban, alginátban, xantánban és cellulózszármazékokban a hidroxilcsoportok előtt króm-savval aldehidekké oxidálódnak, ezek az aldehidcsoportok redukálják az ezüst-nitrátot, barnás-feketén mutatják, majd aranykloriddal tonizálják 44. oldal
45 Speciális foltok: Grokott festés Értékelés: Szénhidrátok (KH): fekete Izmok: rózsaszín Kötőszövet: rózsaszín Növényi fehérje: rózsaszínű, ha növényi, azaz szénhidráttartalmú fehérje részecskéket észlelnek, a fekete színű szénhidrátok a rózsaszín fehérje részecskékben tárolódnak, annál tisztábbak a növényi fehérjék, minél kevesebb szénhidrát van jelen és detektálható amilázkezelés a keményítő és az analóg struktúrájú szénhidrátok megkülönböztetésére - más szénhidrátok 1,4-kötésével, amilázkezelés párhuzamos vágásokon hajtható végre a festés előtt Az eredmény amilázkezelés után keményítő és hasonló szerkezetű szénhidrátok α-1,4-gyel link nem észlelhető 45. oldal
46 Grokott-festési lehetőségek: Fehérjében gazdag, növényi lisztek és fehérjekészítmények kimutatása Növényi fehérje-készítmények: szója, gyapotmag, csillagfürt, repce, napraforgó, búza, kukorica, lencse, bab Morfológiai kritériumok: Lisztek: Szójaliszt palisade és óraüveg cellái Fehérje készítmények: pl. TVP - búzasikér szivacsos szerkezete, ringlet típusú szójafehérje Határértékek: a hidrolizátumok nem detektálhatók, a növényi fehérje típusa nem határozható meg, a morfológia információt nyújt a származási oldalról 46. oldal
47 Grokott színes főtt kolbász (Wiener) 200x 47. oldal
48 Bauer-Calleja-F./Periodikus savhajó s Reganz-F. Differenciálfestés Mindkét folt az 1,2 diolcsoportot tartalmazó szénhidrátok kimutatására szolgál a TVP növényi fehérje készítményeiben a sejtfal komponenseinek maradványait (szénhidrátokat), amelyek a fehérje részecskékben zárványként jelennek meg. A Bauer-Calleja festést az ASU szerint végezzük, krómsavval oxidálva.: a festék 2 szomszédos szabad aldehidcsoporthoz kötődik, alternatív megoldásként a kevésbé agresszív periodikus sav használható oxidációra (= PAS színezés) Alapelv: olyan poliszacharidokat detektálunk, amelyekben két hidroxilcsoport található a közvetlenül szomszédos szénatomokon (1,2 diolcsoport) gyere pl. keményítőben, guarlisztben, szentjánoskenyérlisztben, agarban, alginátban, xantánban és cellulózszármazékokban a hidroxilcsoportok előtt aldehidekké oxidálódnak krómsav (Bauer-Calleja folt) vagy periodikus sav (PAS) 48. oldal
49 Bauer-Calleja-F./Periodikus savhajó s Reganz-F. (PAS) Értékelés: Szénhidrátok: vörös-ibolya izmok: zöld rugalmas kötőszövet: sárga kollagén. Kötőszövet, porc, csontok: halványkék növényi fehérje: zöld amilázkezelés a keményítő és az analóg struktúrájú szénhidrátok megkülönböztetéséhez - más szénhidrátoktól 1,4-kötéssel, amilázkezelés végezhető párhuzamos szakaszokon a festés előtt.Az amilázkezelés után keményítő és az α-val hasonlóan strukturált szénhidrátok -1,4-kötés nem észlelhető Lehetőségek és korlátok: mint a Grokott színező oldal 49. oldalán
50 Periódusos savhajó s Reganz-F. (PAS) főtt kolbász (lengyel bécsi) 200x 50. oldal
51 Következtetések A húskészítmények és kolbásztermékek szöveti összetételének meghatározása az utóbbi években ismét fontossá vált, és nem helyettesíthető modern elemzési módszerekkel, mivel számos kérdésben közvetlen detektálási módszer nélkülözhetetlen a minőség szempontjából releváns, minőséget csökkentő, tiltott és deklarálható összetevők meghatározásához. lehetővé teszi a felhasznált összetevők megkülönböztetését, azonosítását és mennyiségi meghatározását, és információt nyújt a gyártási technológiáról Az általános felfogástól való eltérés szokatlan szövetek használatából, megnövekedett fokú aprításból vagy a felszabadult izomfehérje mennyiségéből vagy újrafeldolgozott hús hozzáadásából eredhet.
52 Következtetések Nem húskomponensek, például növényi fehérje készítmények, sűrítőanyagok, nagy molekulájú kötőszöveti hidrolizátumok vagy növényi rostok hozzáadását, amelyek deklarálást igényelnek, vagy amelyek a terméktől függően nem engedélyezettek, speciális színekkel detektálják. A színezett készítmények értékelésére általában a Calleja vagy a Calleja-Lugol színű készítmények mikroszkópos értékelését használják. Eladhatóság elégséges! 52. oldal
53 Köszönöm a figyelmet! Kapcsolattartó: Alexandra Bartholomä Tanácsadás és értékelés Tel .: +49 (2151) Fax: +49 (2151) Rhein-Ruhr-Wupper AöR Vegyi és Állat-egészségügyi Nyomozó Iroda, 53. oldal Deutscher Ring 100, Krefeld Internet: