11-21% szénhidrát 01% zsír 0,1 2% fehérje

Membránadszorberek és szűrőrendszerek alkalmazása burgonyafehérjék célzott feldolgozásához Thomas Scheper, Alain Graf, S. Beutel, M. Lotz, R. Ulber Leibniz Universität Hannover Callinstr. 3 30167 Hannover, Németország 1

A burgonya jelentősége Körülbelül 220 vadfaj és 2000 világszerte ismert fajta jelentősége A világ 2004-ben évente 300 millió tonna termést eredményez az EU-ban 2,7 millió hektár megművelt területen; Termés 65 millió t Kb. 30% keményítőburgonya (25-30 különböző fajta) Kampányművelet (étkezési burgonya júniustól szeptemberig; keményítőburgonya augusztustól januárig) 2

A keményítőburgonya összetevői 11-21% szénhidrát 01% zsír 0,1 2% fehérje 2% rost 72% víz aminosavak, vitaminok és ásványi anyagok víz 72% burgonya aminosavak 2% keményítő 20% fehérje 2% egyéb összetevők 2% rostok 2% 3

Ipari keményítőgyártás (emslandi keményítő) Burgonya Burgonyamosó Reszelő Decanter Reverz ozmózis Keményítő és rost Magas fehérjetartalmú másodlagos áramlású elválasztó (keményítő kimosása) Burgonya gyümölcsvíz (KFW) Keményítő 4

Burgonyafehérje hozzáadott értéke Kb. 6 millió t KFW Európában Víz 94% Burgonya gyümölcsvíz Aminosavak 2% Egyéb komponensek 2% Az adatok szerint kb. 120 000 t burgonyafehérje Keményítő 0,5% Fehérjék 2% KFW fehérjék összetétele: 40% patatin (fő glikoprotein) ) 50% proteázinhibitorok (kisebb fehérjék) 10% nagy molekulatömegű fehérjék (polifenol-oxidázok, kinázok, foszforilázok) 5

362 aminosavból álló (lizinben és tirozinban gazdag) patatin-glikoproteinek, MW = 40-44 kda, pi = 4,5-5,2 (különböző glikozilezési mintázattal rendelkező izoformák) Enzimaktivitások: lipid transzferáz aktivitás, lipid acil hidroláz aktivitás, észteráz aktivitás, Osborne és Campbell J. Am. Chem. Soc. 1986, 18, 575, Jacusen és Foote, J. Food Biochem. 1980, 4, 43 6

A proteázgátló csoport (PI) hőstabil ciszteinben gazdag fehérjék heterogén osztálya, MW = 4-23 kda; pi = 5.1-9.0 90 szerepet játszik a növény védekezésében a kártevők stb. ellen. A szerin és a cisztein proteáz gátló hatása Elősegíti a jóllakottság érzetét (II. proteáz inhibitor) Lehetséges antikarcinogén hatás 7 Kennedy és mtsai., Pharmacol. Ther. 1998, 78, 167-209. Pouvreau és mtsai., J. Agri és Food Chem 2001, 49 (6), 2864 Hill és mtsai., Physiol és Behav. 1990, 48, 241

Burgonyafehérje-frakciók alkalmazása Gyógyszerek Baba- és speciális ételek Sporttáplálkozás (Amino Mass) Marketing étvágycsökkentőként (Satise) Orvosi felhasználás Cukorbetegség II és bőrrák kezelése

Nutraceuticals Pozitív élettani hatású élelmiszerek A betegség elleni küzdelem/a megelőzés és a teljesítmény/jólét növelése A teljes élelmiszerpiac növekedésével (évi 1-3%) összehasonlítva a táplálékipar piaci volumene évente körülbelül 8% -kal növekszik (a becsült világpiac 12 milliárd euró) ) Követelmények: jó ízű, praktikus, könnyen érthető hatású, olcsó, jól néz ki 9

A KFW burgonyafehérje értékteremtése denaturált terméket eredményez A technika állása Fehérje kicsapódás 110 C Nincs bioaktivitás Alacsony minőségű állati takarmány forgalmazása A burgonyafehérje kilogrammonként denaturált ára burgonyafehérjeként Szarvasmarha takarmány: 0,5–1 egyszerű élelmiszer-adalékanyag: 4–6 Vision KFW membrán adsorber folyamat frakcionált burgonyafehérje (natív) a bioaktív fehérjefrakciók izolálása (natív) marketing, kiváló minőségű funkcionális összetevőként

fehérje keverék (a fehérjék izoelektromos pont szerint kötődnek) - -SO - 3 OS- 3 - -SO 3 - OS- 3 - -SO 3 - OS- 3 profil a membrán pórusméretén keresztül: kb. 3,0 µm membránvastagság: 180-200 µm lapos modul (analitikai célokra) spirál modul (fehérje lefelé irányuló) függőleges áramlás a membrán felületéhez vertikális áramlás a membrán felületéhez

A downstream anyagligandumok sokfélesége (kationos c-csoportok, 2+ 2+ antitestek, Ni, Cu) Alapanyag (membrán, gyöngyök) downstream körülmények között (pl. Elektromos mező) megkötőkémia (aldehid, epoxi)

célfehérje ligandum immunglobulinok rt-pa, rh-gh glyc. fehérjék sztreptavidin His-tag-fehérjék plazmidok, fehérje fehérje A antitest concanavalin A biotin Cu, Ni aptameres

8 lyukú csíkokkal felállított lemez

Intelligens szűrési minta betöltése

kationcserélő anioncserélő protein A His-tag antitest Con A

minta hozzáadása csapdázó membránon

kationcserélő minta 6 anioncserélő minta 4 fehérje A minta 11 His-tag minta 3 antitest minta 10 Con A minta 1

01 0,1 02 0,2 03 0,3 04 0,4 05 0,5 06 0,6 07 0,7 08 0,8 09 0,9 10 1,0 11 1,1 12 1,2 kationcserélő anioncserélő minta 6 minta 4 fehérje A minta 11 His-tag minta 3 antitest minta 10 Con A minta 1 nátrium-klorid gradiens

Nagyobb méretarányú membránadszorber Egyszerű méretezés Különböző geometriák és működési módok Centrifuga modulok (1,9 7,5 cm 2) Legfeljebb 2 mg fehérje/cm 2 Sartobind modulok (15, 75, 100 cm 2) Legfeljebb 0,8 mg fehérje/cm 2 24 Sartobind MultiSep-modul modul (0,1 80 m 2) Legfeljebb 0,8 mg fehérje/cm 2

Fehérje-elválasztás membránadszorberekkel

Eredmények laboratóriumi léptékben Q-frakció: Patatin S-frakció: Kevesebb fehérje 2,00 1,0 1,75 100 0,9 100 1,50 80 0,8 80 AU [280 nm] 1,25 1,00 0,75 60 40 eluens% AU-ban [280 nm] 0,7 0,6 0,5 0,4 60 40 eluens% 0,50 20 0,3 20 0,25 0 0,2 0 0,00 0 5 10 15 20 25 30 35 T idő [percben] 0,1 0 5 10 15 20 Idő t [percben] Q15 modul töltési és eluálási profilja S15 modul elúciós profilja 26

Eredmények laboratóriumi méretekben Folyamatlépések A membránmodul kiegyenlítése 50 mm NaPP-vel (ph 7) KFW-vel töltve (1: 5 arányban hígítva, ph 6,5) Öblítés 50 mm NaPP-vel (ph 7) Elúció 0,5 M NaCl oldattal Membrán regenerálás 1 M NaCl-oldat töltőtérfogata 0,7 L/m² membránterület-megkötő képesség S adszorber: 0,67 mg/cm² Q adszorber: 0,23 mg/cm² 27

Fehérje-elválasztás membránadszorber SDS-PAGE alkalmazásával (Tris-HCL, 18%, Coomassie festés) 1. sáv: Molekulatömeg-marker lk 2. sáv: Burgonya gyümölcsvíz 1:10 hígítással 3. és 4. sáv: Elúciós frakció (0,5 M NaCl, Q 15) 5. sáv: Mosási frakció sáv 6. ábra: Elúciós frakció (0,5 M NaCl, S 15) 28

A Q frakció jellemzése - MALDI-MSMS 29

Az S frakció jellemzése - MALDI-MSMS 4153 7879 7857 Étvágycsökkentő: SATISE S frakció Kunitz inhibitor KI Bowman Birk inhibitor BBI karboxipeptidáz inhibitor CPI 20305 100 4271 intenzitás [%] relatív Int 80 60 40 20 4144 3890 4292 8058 10101 20227 S frakció KI BBI CPI 0 étvágycsökkentő 5000 10000 15000 20000 25000 tömeg (m/z) 30

Nagyítás a folyamat skálájára Sartobind modulok (15, 75, 100 cm 2) Sartobind MultiSep modulok (6600 cm 2) 31

Innovatív membrán downstream downstream eljárás KFW elsődleges tisztító/mikrofiltrációs szilárd anyagok (fehérjék, keményítő, rostok stb.) Membránadszorpció nélkül fehérjével KFW (Q) - membránadszorpció 6600cm² (S) membránadszorpció 6600cm² (S) membránadszorpció 6600cm² Retentát liofilizálás/porlasztva szárítás liofilizálás/porlasztva szárítás patatin proteáz inhibitorok xx.xx.2007 32

Eredmények a folyamat skálán V. folyamatlépés [L] t [min] P [bar] Kiegyensúlyozás 5 32 3,2 20 2,0 (20 mm NaPP, ph 7) hígítva, ph 6,5) Öblítés (20 mm NaPP, ph 7) 10 4,2 2,2 Elúció Q modul 7,5 3,0 0,8 (0,5 M NaCl) Elúció S modul 6,0 2,3 1,0 (0,5 M NaCl) membránregenerálás (1 M NaCl) 5,0 2,0 0,8 S-adszorber kötődési képesség: 1,00 mg/cm² (kicsi: 0,67 mg/cm 2) Q adszorber: 0,37 mg/cm² (kicsi: 0,23 mg/cm2) 33

Az 1 m2 membrán felhasználásával kapjuk meg (jelenleg elérhető a KFW-ben lévő fehérjék 80% -ának megkötése és eluálása): - 3,7 g patatin - 10 g proteáz inhibitorok - ez 20-25 percet vesz igénybe, növekedés a membrán területe nem vezet az idők növekedéséhez. Használja a KFW 1: 5-et hígítva 5 L/1 m 2 xx.xx.2007 34

Gél- és kapilláris elektroforézis Termékelemzés Mosási frakciók Elúciós frakciók Au (214 nm) S frakció Q frakció kda 100 85 70 60 50 40 30 KFW Q membrán S membrán 25 20 0 5 10 15 20 25 Migrációs idő [perc] Enzimatikus aktivitás vizsgálatok 15 M patatin (Lipid-acil-hidroláz) patatin teszt A proteáz inhibitor aktivitásának meghatározása tripszinnel szemben Polifenol-oxidáz aktivitás vizsgálatok l ität 35 PI

Zavaró összetevők: A glikoalkaloidok főleg a burgonyahéjban és a csírákban találhatók, 20-2525 mg/100g friss termék toxikus küszöbként. Tünetek: torokfájás, hányinger/hányás, hasmenés, gyomor- és bélgörcsök, fejfájás, láz, légszomj, szédülés, eszméletvesztés D-galaktóz N D- Glükóz N HO HO OH L-glükóz O β O OH OH OH O β OO HO α O CH 3 OH OH L-ramnóz α-szolanin: MW 868,08 g/mol H 3 C HO HO O L-ramnóz α O HO OH OH OO α HO β OO CH 3 OH OH L-ramnóz α-chaconin: MW 852,08 g/mol 36 maga; Crit. Rev. Food Sci Nutr 1980; Lee, 12 (4), 371 és mtsai; J Agric Food Chem. 2004; 52 (10), 2832

HPLC glycoalkaloid analízis Burgonyafehérje (frakció) ecetsav extrakció Szilárd fázisú tisztítás HPLC analízis Eredmény 0,15 Szolanin standard Chaconin standard burgonyafehérje kivonat AU (200 nm m) 0,10 0,05 Chaconin lanin So 000 0,00-0, 05 0 5 10 15 20 25 30 35 retenciós idő [perc] Kvantitatív glycoalkaloid meghatározás 20 ppm-ig, a membránadszorberekkel nyert frakciók alkaloidmentesek ! 37

Következtetés A burgonya gyümölcsvíz nagy mennyiségben tartalmaz biológiailag értékes fehérjéket. A fehérjéket eddig hő koagulációval denaturálták (szarvasmarha-takarmány). Innovatív membránfolyamat alkalmazásával a fehérjék finoman frakcionálhatók és bioaktív formában izolálhatók. Az ipari i hulladékáram (KFW) nagy hozzáadott értéke a laboratóriumi méretekből a ipari méret lehetséges 38

Ipari keményítő- és fehérjetermelés Burgonya Burgonya mosás Reszelő dekantátor Fordított ozmózis Keményítő és szálas anyagok KFW Szeparátor (a keményítő kimosása) Innovatív membránfolyamat Fehérje kicsapás 110 C Keményítő frakcionált burgonyafehérje (natív) Denaturált burgonyafehérje xx.xx.2007 39

Fehérjetermelés Burgonya gyümölcsvíz Membrán utólagos folyamat Natív bioaktív fehérje frakciók Patatin proteáz inhibitor frakció Enzimaktivitások: lipid transzferáz aktivitás lipid acil hidroláz aktivitás észteráz aktivitás MW = 40-44 44 kda, pi = 4,5-5,2 5.2 xx.xx.2007 41 Gátló hatás a szerin és a cisztein proteázra, MW = 4-23 kda; pi = 5,1-9,0

A fehérjefrakciók áttekintése Fehérje arány [%] Molekulatömeg [kda] Patatin ti 38 40 (80) I. burgonyagátló (PI-1) 4,5 7,7–7,9 (39) II. Burgonyagátló (PI-2) 22 10, 2 (21) burgonya-aszpartil-proteáz-inhibitor (PAPI) 6 19.9-22 Burgonya-ciszteinil-proteáz-inhibitor (PCPI) 12 20.1-22.8 Burgonya-Kunitz-proteáz-inhibitor (PKPI) 4 20.22 Egyéb szerin-proteáz-inhibitorok (OSPI) ) 1,5 21-21,8 burgonya-karboxi-petidáz inhibitor (PCPI) 1 4,3 Polifenoloxidázok (PPO) nincs információ 60; 69 Foszforiláz-izoenzimek nincs információ 180-600 Keményítő-szintézisek nincs információ 140 Protein-kinázok nincs információ nincs információ Lectin 1 65,5 xx.xx.2007 42

Megújuló nyersanyagok Mezőgazdasági és erdészeti termékek, amelyeket a nem élelmiszeripari ágazatban használnak (különösen a bioenergia előállítására) Mezőgazdasági maradványok Tejsavó (tejfeldolgozás) Melasz (cukorrépa-feldolgozás) Burgonya gyümölcsvíz (keményítőgyártás) Ulber; CIT 2005., 77. szám, 4. sz., 363. xx.xx.2007 43

Burgonyakeményítő Éves termelés az EU-ban 9.1 A Miot keményítőburgonya keményítőtartalma legfeljebb 21% (étkezési burgonya kb. 15%) Rizs kb. 70-7575%, búza 58-64%, kukorica 60-70% A keményítő 20% amilózt tartalmaz és 80% amilopektin Forrás: Keményítőipar Egyesület, 2007

Ipari keményítőgyártás (emslandi keményítő) Burgonya Burgonyamosó Reszelő Dekanter Reverz ozmózis Keményítő és rost Magas fehérjetartalmú másodlagos áramlású elválasztó (keményítő kimosása) Burgonya gyümölcsvíz (KFW) Keményítő xx.xx.2007 45

Keményítő felhasználása Műszaki termékek (papír, ragasztók, építőanyagok, textíliák) A kozmetikai termékek 50% -át ma feldolgozzák az élelmiszeriparban.

A proteázinhibitorok csoportja Fehérje A KFW fehérje aránya [%] Móltömeg [kda] I. burgonyagátló (PI-1) 4,5 7,7–7,9 (39) Burgonyagátló II (PI-2) 22 10, 2 (21) burgonya-aszpartil-proteáz-gátló (PAPI) 6 19.9-22 burgonya-ciszteinil-proteáz-gátló (PCPI) 12 20.1-22.8 burgonya-Kunitz-proteáz-gátló (PKPI) 4 20.2 Egyéb szerin-proteáz-gátló (OSPI) 15 1,5 21-21,8 burgonya-karboxi-petidáz inhibitor (PCPI) 1 4,3 47

A burgonyafehérje minősége Magas tápanyagminőség: 120 korlátozó: Triptofán 100 max. Aminosav pontszám (AAS) 80 tisztán növényi 60 magas arányú glutamin vagy g fehérje] Anfo [mg/g 40 FAO/WHO standard burgonyafehérje Emsland keményítő 20 0 FAO/WHO- Ajánlás (1990): Fehérje emészthetőséggel korrigált AAS = AAS x széklet valódi emészthetőség Ile Leu Lys Met + Cys Tyr Thr Trp Val Fehérje biológiai érték emészthetősége [%] AAS PDCAAS FAO/WHO/UNU szakértői konzultáció (1985), Energia és fehérje követelmények, Műszaki jelentés sorozat 724. Egészségügyi Világszervezet, Genfi marhahús 80 98 0,94 0,92 Tojás 100 98 100 1,00 100 1,00 Jelentéssorozat 724. Egészségügyi tehéntej világa 91 95 1,00 1,00 Szója 74 95 0,96 0,91 Búza 64 91 0,47 0,42 Burgonya t 69–100 1,00 - Schaafsma, G. (2000), A fehérje emészthetőséggel korrigált aminosav pontszáma. Journal of Nutrition 130, 1865-1867 48

Jellemzése A Q csoport - MALDI MSMS aminosav szekvencia: 1 MATTKSFLIL FFMILATTSS TCAKLEEMVT VLSIDGGGIK GIIPAIILEF 51 LEGQLQEVDN NKDARLADYF DVIGGTSTGG LLTAMITTPN ENNRPFAAAK 101 DIVPFYFEHG PHIFNYSGSI LGPMYDGKYL LQVLQEKLGE TRVHQALTEV 151 AISSFDIKTN KPVIFTKSNL AKSPELDAKM YDICYSTAAA PIYFPPHHFV 201 THTSNGARYE FNLVDGAVAT VGDPALLSLS VATRLAQEDP AFSSIKSLDY 251 KQMLLLSLGT GTNSEFDKTY TAEEAAKWGP LRWMLAIQQM TNAASSYMTD 301 YYISTVFQAR HSQNNYLRVQ ENALNGTTTE MDDASEANME LLVQVGETLL 351 KKPVSKDSPE TYEEALKRFA KLLSDRKKLR ANKASH A triptikus emésztés olyan peptidtömegeket eredményez, amelyek megfelelnek az elméleti emésztésnek. A patatin egyértelmű azonosítása adatbázis összehasonlítással xx.xx.2007 49

Az S-frakció jellemzése - MALDI-MSMS intenzitás [%] 100 80 60 40 S 75 frakció

4300 Da Kunitz inhibitor (kb. 20 kda) Karboxipeptidáz inhibitor (kb. 4300 Da) S 75 frakció

20305 Da 20 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 m/z xx.xx.2007 50

kationcserélő anioncserélő protein A His-tag antitest Con A

minta hozzáadása csapdázó membránon

kationcserélő minta 6 anioncserélő minta 4 fehérje A minta 11 His-tag minta 3 antitest minta 10 Con A minta 1

8 lyukú csíkokkal felállított lemez

A membrántechnológia előnyei Magas elválasztási teljesítmény és kapacitás Enyhe eljárási feltételek lehetségesek Konvektív anyagátadás, minimalizált diffúziókorlátozás Nagy teljesítmény, csökkentett feldolgozási idő 62