A fiziológiai stresszválaszok mérése C-ben

Összegzés

Itt jellemezzük a sejtes proteotoxikus stressz reakciókat a C. elegans fonálféregben a fluoreszcens transzkripciós riporterek aktivációjának mérésével és a fiziológiai stressz érzékenységének megfigyelésével.

Absztrakt

Bevezetés

A sejtes stresszválaszok szabályozásáról és aktivitásáról sok ismeretet tulajdonítottak a genetikai kutatások során a Caenorhabditis elegans fonálféregnek, egy többsejtű modell organizmusnak. A fonálférgek nemcsak a stresszreakciók aktiválódását vizsgálják sejtszinten, hanem a szervezet szintjén is; A fonálférgeket arra használták, hogy tanulmányozzák a genetikai rendellenességek, illetve a kábítószerek és szennyező anyagok expozíciójának növekedésükre és túlélésükre gyakorolt hatását. Gyors generációs idejük, izogenitásuk, transzparenciájuk, genetikai vonóerejük és a kísérletezés közbeni használatuk egyszerűvé teszik őket az ilyen vizsgálatokhoz. Ezenkívül a viszonylag gyors fiziológiai válasz a stresszre (órák és néhány nap között) és a sejtpályák evolúciós megőrzése kiváló fonálférgekké teszik a fonálférgeket a stressz-rezisztencia vizsgálatában.

A riporterelemzés mellett fiziológiai stressztesztekkel is mérhető az állatok stressz iránti érzékenysége vagy ellenállása. Ez úgy érhető el, hogy az állatokat olyan stresszes környezetnek teszik ki, amely bizonyos sejtes stressz útvonalakat aktivál. Különböző módszereket kínálnak itt az egész állatok érzékenységének mérésére bizonyos típusú stresszorokkal szemben.

Az ER stresszt a C. elegansra alkalmazzák a tunikamicin kémiai ágens alkalmazásával, amely blokkolja az N-hez kötött glikozilezést és rosszul összehajtott fehérjék felhalmozódását okozza az ER 10-ben. A C. elegans-ban a növekedés jelentős zavarokhoz vezet az ER működésében, és jelentősen csökkent az élettartama a tunikamycin 11-nek való kitettség hatására. Az állatok túlélését tunikamicint tartalmazó lemezeken mérve meghatározható az állatok ER stresszérzékenysége. Például azoknak az állatoknak, akiknek méhen kívüli UPR-ER indukciója van, és így az ER-ben fokozottan ellenáll a fehérje rosszul összecsapódó stresszének, a tunikamicin-expozíció után megnő a túlélés a vadállatokhoz képest 12. Ő

Oxidatív és mitokondriális stresszt alkalmaznak a C. elegans-ra úgy, hogy az állatokat a paraquat kémiai ágensnek teszik ki. A parakvát egy általánosan használt herbicid, amely kifejezetten a mitokondriumokban okoz szuperoxid-képződést 13. A mitokondriumokból származó reaktív oxigénfajok (ROS) specifikus lokalizációja miatt a paraquat vizsgálatokat gyakran használják "mitokondriális" stressztesztként. A szuperoxid azonban mitokondriális szuperoxid-diszmutázok (SOD-k) révén gyorsan hidrogén-peroxiddá alakul. A hidrogén-peroxid ezután diffundálhat a mitokondriumokból, és oxidatív stresszt okozhat a sejt más részeiben. Ezért a paraquat túlélési vizsgálatokat mind a mitokondriális, mind az oxidatív stressz iránti érzékenység mértékeként írjuk le (más oxidatív stressz vizsgálatok lásd: 15.).

A termikus kompatibilitási vizsgálatokat C. elegans-ban végezzük, magas hőmérsékleten tartva az állatokat. A fonálférgek környezeti hőmérséklete 15-20 ° C, és a hőfeszültség 25 ° C feletti hőmérsékleten vált ki 16, 17. A termikus kompatibilitási teszteket általában 30-37 ° C hőmérsékleten hajtják végre, mivel az állatok ezen a hőmérsékleten nagy sejthibákkal rendelkeznek, és a túlélési teszteket 24, 16, 18 órán belül befejezik. Két alternatív módszert fontolgatunk meg itt a termotolerancia vizsgálatok elvégzése során: növekedés 34 ° C-on és növekedés 37 ° C-on. Az itt bemutatott protokollok együttesen felhasználhatók nagyméretű szűrések elvégzésére, standard R-interferenciával vagy kémiai gyógyszerkönyvtárakkal kombinálva.

A protokoll 4 általános eljárásra bontható - C. elegans szaporodása és előkészítés a képalkotáshoz (1. és 2. szakasz), transzkripciós riporterek képalkotása fluoreszcens mikroszkóppal (3-5. Szakasz), riporterek kvantitatív mérése nagy részecske áramlás segítségével - Citométer (6. szakasz) és élettani tűk a stresszérzékenység mérésére C. elegans-ban (7. szakasz).

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

1. A hőmérséklet és az OP50 vs HT115 szokásos termesztési körülményei

2. A férgek stádiumozása/szinkronizálása fehérítéssel

5. Képalkotás sztereo mikroszkóppal vagy széles mező/összetett mikroszkóppal kis nagyítással

6. Kvantitatív mérések riporterektől nagy részecskeáramú citométerrel

MEGJEGYZÉS: A férgek növekedése és előkészítése a nagy szemcsékkel rendelkező teljes hosszúságú citométer elemzéséhez ugyanazokat a paradigmákat követheti, mint az 1-5. Szakasz, a férgek fluoreszcencia képalkotáshoz történő előkészítéséhez, azzal a különbséggel, hogy nagyobb számú állat szükséges . Használjon feltételenként> 500 állatot, mivel néhány állat elveszik a manipuláció során, a mennyiségi meghatározás során nem minden állat felel meg a szűrési kritériumoknak, és egyes állatokat az áramlási citométer nem fog megfelelően olvasni. Az állatokat a lemezek szétválogatásához mossuk 5-10 ml M9 oldatban, 15 ml-es kúpos csövekben, majd válasszuk az áramlási citométeren.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

Transzkripciós riporterek használata a stresszreakciók aktiválódásának mérésére
Itt alkalmazzák a fluoreszkáló transzkripciós riportereket, amelyek robusztus eszközként szolgálnak a legtöbb stresszválasz aktivációjának mérésére C. elegans-ban. A GFP expressziót a kánonikus célpontok támogatják, a szubjektum-specifikus stresszek kezelésében részt vevő mester transzkripciós szabályozók. A gyakran használt átírási riporterek átfogó listáját lásd: 3. táblázat.

Fiziológiai vizsgálatok a C. elegans stresszre való hajlamának mérésére
A C. elegans remek modellszervezet a stresszérzékenység mérésére a karbantartás és a kísérletek alacsony költsége, valamint a genom szerkesztésének vagy az RNSi-vel végzett genetikai leütésnek köszönhetően, amely lehetőséget nyújt nagyszabású kísérletek elvégzésére egy egész szervezetben. Az ER stressz iránti stressztűrés vizsgálatához a C. elegans-t kitettük a kémiai tunikamicinnek, amely a károsodott fehérjék felhalmozódását okozza az ER-ben az N-kapcsolt glikoziláció blokkolásával 10. Az állatok fejlesztés után ki vannak téve a tunikamicinnek, mert a gyógyszer fejlődési rendellenességeket okoz. Tunikamicin hatásának kitett felnőtt férgek élettartama jelentősen csökken. Ezenkívül az xbp-1 gén leütése, amely az UPR ER indukciójában szerepet játszó egyik elsődleges transzkripciós tényezőt kódolja, a tunikamicin iránti érzékenység jelentős növekedéséhez vezet (5. ábra)A.) 12. ER Így ez robusztus tesztként szolgál az ER stressz érzékenységének mérésére felnőtt férgekben.

Az oxidatív stressz és a mitokondriális stressz mérésére az állatokat a paraquat kémiai vegyületnek tesszük ki. A parakvat a mitokondriális stresszt okozza azáltal, hogy a mitokondriális mátrixban szintetizálja a ROS-t, amely aztán hidrogén-peroxiddá alakulhat át, és a mitokondriumokból diffundálva teljes sejt oxidatív károsodást okozhat 13. Az ER stressz vizsgálatokhoz hasonlóan, az állatokat felnőttkorban paraquatnak tesszük ki. Folyékony paraquat vizsgálatokat végezünk azonban a költségek és a kézi munka csökkentése érdekében, és az agar lemez alapú vizsgálatok a legtöbb laboratórium számára nehézkesek lennének. Itt bemutatjuk, hogy a folyékony folyadékban paraquatnak kitett állatok átlagos túlélése körülbelül 5 óra (5. ábra)B.). Ezenkívül a daf-2 inzulinreceptor leütése fokozott ellenállást eredményez a paraquattal szemben, mivel a DAF-16/FOXO aktiválása a ROS-clearance-ben részt vevő fajok fokozottabb expressziójához vezet, pl. B. Sod-3 42, 43. A parakvát túlélési tesztek rövidek, legfeljebb 14 óráig tartanak, és így hatékony módszerként szolgálnak a mitokondriális és oxidatív stressz válaszok megkérdőjelezésére.

3. táblázat: Transzkripciós riporter a sejtes stressz válaszok aktivációjának értékeléséhez. Az itt felsorolt törzsek mind elérhetők a CGC-n vagy speciális laboratóriumi vizsgálatokon keresztül, amelyek felhasználhatók az ebben a kéziratban leírt kvalitatív és kvantitatív képalkotó eljárásokban. Ezek a törzsek mind a Bristol N2 háttérből származnak. Az újságírók aktiválásához ajánlott módszerek a stressz alkalmazására is. Az összes riportert, a sod-3p: GFP 45 és T24B8.5p: GFP 46 kivételével, a szöveg írja le.

Transzgenikus	A feszültség ajánlott alkalmazása (i)	Expozíciós idő Leica M2250FA sztereo mikroszkóppal	Expozíciós idő Revolve ECHO mikroszkóppal	PMT értékek egy Union Biometrica COPAS szerves válogatóval
hsp-4p: GFP	25 g/ml tunikamicin (kb. 4 óra éjszakai helyreállítással)	200 ms	275 ms	450
hsp-6p: GFP	3 M antimycin A (kb. 16 óra);	100 ms	50 ms	350
hsp-6p: GFP	RNAi ETC vagy mitokondriális riboszóma ellen (a sraffozásból)	100 ms	50 ms	350
hsp-60p: GFP	3 M antimycin A (kb. 16 óra);	200 ms	100 ms	450
hsp-60p: GFP	RNAi ETC vagy mitokondriális riboszóma ellen (a sraffozásból)	200 ms	100 ms	450
hsp-16.2p: GFP	34 ° C 2 óra	400 ms	200 ms	500
hsp-70p: GFP	34 ° C 2 óra	400 ms	300 ms	500
gst-4p: GFP	50 mM paraquat (kb. 2 óra);	100 ms	50 ms	350
gst-4p: GFP	2 mM terc-butil-hidroperoxid (kb. 4 óra éjszakai visszanyeréssel)	100 ms	50 ms	350
sod-3p: GFP	RNAi a Daf-2 (inzulin receptor) ellen	300 ms	300 ms	475
T24B8.5p: GFP	Kórokozó-expozíció (pl. P. aeruginosa)	100 ms	50 ms	350

4. táblázat: A fluoreszcencia mikroszkópia és a kvantifikálás ajánlott beállításai nagy részecske bioszorterrel. Ez a táblázat útmutatóként szolgál a fluoreszcens mikroszkópia javasolt expozíciós idejéhez vagy a PMT-értékekhez a nagy részecske-bioszorterhez. Ezek jó kiindulási pontként szolgálnak, de az expozíciós időt és a PMT értéket minden kísérlethez módosítani kell annak biztosítása érdekében, hogy a telítettség ne forduljon elő, és hogy a fluoreszcencia értékek meghaladják a háttérjel detektálási határát. Ha egy kísérlethez ismert a legfényesebb jelű minta (pl. A feszültség indukciójának pozitív kontrolljai), akkor ezek a minták felhasználhatók a telítettségjel nélkül használható legnagyobb expozíciós idő vagy PMT meghatározására. Ha a legfényesebb minták nem ismertek, akkor a vezérlő használható, és a rendszer dinamikus tartományának közepén található expozíciós idő vagy PMT használható.

6. táblázat: Ajánlott géncélok és primerpárok a stressz-válasz gének transzkripciós upregulációjának mérésére.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

A leírt módszerek másik korlátja, hogy a bioszorterrel történő képalkotás és mennyiségi meghatározás korlátozott átbocsátási képességgel rendelkezik. Míg a kvantitálást elvégezhetjük 96 lyukú lemezeken lévő bioszortálókon a nagyobb áteresztőképesség érdekében, ezt még mindig korlátozza a férgek oldatba való átvitelének igénye, míg a képalkotást a vizsgáló képessége korlátozza a férgek előkészítésére és a mikroszkópia elvégzésére, korlátozott. Ezért a nagy képernyők valószínűleg csak a fluoreszcens riporterjel vizuális szűrését tartalmazzák, csak a találatokat térképezik fel és számszerűsítik.

Az itt leírt módszerek bármelyike alkalmazható függetlenül vagy kombinációban az érdeklődésre számot tartó gének vagy gyógyszerek és azok stresszválaszra gyakorolt hatásainak átfogó elemzéséhez. A nagy formátumú képernyők nagy áteresztőképességű transzkripciós riportervizsgálatokkal futtathatók, a másodlagos képernyők pedig futtathatók ezen riporterek kvantitatív elemzésével. Amint a kezelhető jelölt gén/gyógyszer listákat ismét azonosítják, fiziológiai teszteket lehet végezni azon jelöltek azonosítására, amelyek közvetlen hatással vannak az állat teljes fiziológiájára. A fentebb javasolt egyéb módszerek szintén használhatók validálásra vagy további vizsgálatokra.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.