A glomeruláris kinövés mint ex vivo vizsgálat a parietális hámsejtben részt vevő utak elemzésére

Összegzés

Ez a cikk egy módszert ismertet az egér veséjéből izolált, kapszulázott glomerulusokból származó glomeruláris parietális hámsejt kinövések tenyésztésére és elemzésére. Ez a módszer felhasználható a parietális hámsejtek szaporodásában és vándorlásában résztvevő utak tanulmányozására.

Absztrakt

Bevezetés

A glomeruláris betegségek a vesebetegségek fontos csoportját jelentik, és a végstádiumú vesebetegségek (ESRD) vezető okai. Sajnos a specifikus kezelési lehetőségek korlátozottak, és az ESRD-re való áttérés elkerülhetetlen. A glomeruláris betegségeket a glomeruláris sérülések jelenléte határozza meg, és gyulladásos és nem gyulladásos betegségekbe csoportosíthatók. Bár a kezdeti sértés más, a legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy egy közös sejtszintű mechanizmus glomeruláris hámsejtek hiperpláziájához és végső soron glomerulosclerosishoz vezet minden glomeruláris betegségben, tekintet nélkül az 1., 2., 3., 4. okra .

Különösen kimutatták, hogy a glomeruloszklerotikus elváltozások főként aktivált parietális hámsejtekből állnak, 5, 6. Fiziológiai körülmények között a parietális hámsejtek lapos, szunnyadó hámsejtek, amelyek a Bowman glomerulus kapszuláját vonják be. Bármely glomeruláris sérülés, akár genetikai mutációk (például podocyta-specifikus vagy mitokondriális citopátiák), akár gyulladás vagy hiperfiltráció (például csökkent vese tömeg, magas vérnyomás, elhízás vagy diabéteszes mellitus okozta) miatt kiválthatja a parietális hámsejtek aktiválódását . Az aktivált parietális hámsejtek szaporodnak és rakják le az extracelluláris mátrixot, ami sejtes félhold szerzetesek vagy szklerotikus elváltozások kialakulásához vezet 5, 7, 8. Ezen folyamatok előrehaladása a veseműködés elvesztéséhez vezet 9. Ezért a parietális hámsejtek aktivációjának aktiválása kulcsfontosságú tényező a glomerulosclerosis kialakulásában és előrehaladásában gyulladásos és nem gyulladásos glomeruláris betegségek esetén 1, 2, 3, 4, 10 .

A parietális hámsejtek aktivációját közvetítő molekuláris folyamatok még mindig nagyrészt ismeretlenek. A legújabb vizsgálatok azt mutatják, hogy az aktivált parietális hámsejtek de novo EXPRESS CD44, egy receptor, amely részt vesz a sejtek proliferációjában és migrációjában különböző utak aktiválásában. Ezenkívül a CD44 gátlása kimutatta, hogy gátolja a parietális hámsejtek aktivációját, és gyengíti a félhold kialakulásának és a glomerulosclerosis progresszióját mind gyulladásos, mind nem gyulladásos glomeruláris betegségek állatmodelljeiben. 11, 12.

Mivel a parietális hámsejtek aktiválása fontos szerepet játszik a glomerulosclerosis és a félhold kialakulásának kialakulásában, e sejtek gátlása lelassíthatja a glomeruláris betegségek progresszióját. A parietális hámsejtek aktiválását előidéző ​​molekuláris utak tisztázása olyan specifikus terápiás beavatkozások kialakulásához vezethet, amelyek csillapítják a hiperplasztikus és glomeruloclerotikus elváltozások kialakulását glomeruláris betegségek esetén.

Kísérleti állatmodellekben gyakran nehéz bizonyítani a megváltozott génexpresszió (knock-out modellek vagy transzgénikus egérmodellek) vagy a gyógyszeres kezelés közvetlen hatását a parietális hámsejtekre. Egy hagyományos knock-out egérben a megfigyelt in vivo változások a parietális hámsejtek közvetlen változásával magyarázhatók. Mivel azonban a génexpresszió az egér más sejttípusaiban is megváltozik, nem zárható ki más közvetett hatások közvetítése. Elsősorban a parietális hámsejtekben aktív promóterek által vezérelt feltételes Cre-Lox egerek kifejlesztése adott esetben 13-ra adott megoldást. A feltételes transzgenikus modellek azonban bonyolultak, és bár egyre több feltételes vonal válik elérhetővé, a hagyományos knock-out vagy transzgénikus egérvonalakat még mindig nem helyettesítik feltételesen.

A parietális hámsejtekre gyakorolt ​​közvetlen hatások tanulmányozásához csoportunk ex vivo vizsgálatot dolgozott ki egér vesékből izolált egyszeres kapszulázott glomerulusok felhasználásával a parietális hámsejtek proliferációjának és migrációjának mérésére és elemzésére. Ez a módszer lehetővé teszi számunkra, hogy meghatározzuk a parietális hámsejt-specifikus hatásokat, és megtaláljuk a felelős útvonalakat a parietális hámsejtek aktivációjához, és kipróbáljuk a kezelési lehetőségeket ezen aktiváció gátlására.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Minden állatkísérletet a Nijmegeni Radboud Egyetem Állatetikai Bizottságának irányelvei szerint hajtottak végre.

MEGJEGYZÉS: Kezeletlen, egészséges vad típusú egereket (n = 4) és cd44 -/- (n = 4) egereket 12-16 hetes korukban feláldoztunk. Mind hím, mind nőstény egereket alkalmaztunk. Minden egér a C57Bl/6 háttéren volt.

1. Feláldozzon egészséges WT egereket vagy genetikailag módosított egereket nyaki diszlokációval.
2. Az egerek feláldozása után azonnal boncolja ki az egér teljes veséjét. Ehhez végezzen egy medián laparotómiát hasi ollóval, vágja le a bőrt, majd a hasi izmokat. Vegye ki a bélet, és tegye az egér mellé.
3. Szabadítsa meg a vesét a szövetek csatlakozásától és húzza ki a vese műtéti fogóval, vágja ollóval a veseartériát, a vénás vénát és az uretert.
4. Vegye ki a vesekapszulákat a vesékből úgy, hogy műtéti csipesszel fogja meg a vesét, és húzza le a kapszulát egy másik fogóval.
5. Készítsük elő a veséket egy 6 üregű sejttenyésztő lemezre (2 vese/üreg), lyukanként 2 ml Von Hanks kiegyensúlyozott sóoldattal (HBSS), és tegyük jégre.

2. A glomerulusok izolálása az egér veséjéből

3. A glomeruláris kinövés termesztése

4. A parietális hámsejtek proliferációjának elemzése

5. A glomeruláris sejtnövekedés jellemzése

MEGJEGYZÉS: A kinövés sejtösszetételének értékeléséhez t = 6 napnál a glomeruláris kinövéseken immunfluoreszcens festést végzünk sejtspecifikus markerekre.

1. Óvatosan távolítsa el a táptalajt, és finoman mossa meg a glomerulusokat kétszer foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS).
2. 10 percig szobahőmérsékleten fixáljuk 2% (w/v) paraformaldehiddel (PFA), 4% (w/v) szacharózzal kiegészítve PBS-ben, és óvatosan mossuk kétszer PBS-sel.
3. A megfelelő koncentrációjú elsődleges antitesttel (Anyagtábla) Inkubáljuk 1% (v/v) hígított PBS-Ovine Serum Albumin (BSA) -ban 1 órán át szobahőmérsékleten.
4. Távolítsa el az antitestoldatot, és gondosan háromszor mossa PBS-sel.
5. Inkubáljuk szekunder antitesttel (Anyagtábla) 1% (v/v) PBS-BSA-val hígítva sötétben 45 percig szobahőmérsékleten.
6. Óvatosan mossa le háromszor PBS-sel, és gyűjtsön össze 1-2 csepp vizes 4,6-diamidino-2-fenil-indollal (DAPI) készített közeggel az atommagok láthatóvá tétele és a kút lefedése érdekében egy kerek fedéllel.
7. Mikroszkópos képeket készíthet fluoreszcens mikroszkóppal.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

1. ábra: A hámsejtek szaporodásának elemzésére szolgáló glomeruláris kinövési vizsgálat végrehajtásának vázlatos áttekintése. (1) A veseit feláldoztuk az egérből, és apróra daráltuk. (2) A veseszövetet a 300 m-es szitán átpréselik, és a 75 m-es és az 53 m-es szitán átöblítik. (3) A szitákon megmaradt glomerulusokat + 20% (v/v) FCS tápközeggel összegyűjtjük, és egy ultra alacsony rögzítőlemezre helyezzük. (4) Az egyes glomerulusokat fordított fénymikroszkóppal összegyűjtjük és 24 üregű tenyésztőlemezekre visszük. (5) 37 ° C-on, 5% (v/v) CO2-on végzett 6 napos inkubálás után a glomerulus kinövése digitális invertált fénymikroszkóppal elemezhető. A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

2. ábra: A WT egerek által boncolt vesékből izolált kapszulázott glomerulusok kinövése. A 37 ° C-on inkubált kapszulázott glomerulusok növekedését különböző időpontokban jelzik: (A.0 nap, (B.) 2 nap, (C.) 4 nap és (D.) 6 nap. A lefejezett glomerulusokat is izoláltuk és 37 ° C-on tenyésztettük, és mikroszkópos képeket készítettünkNap0 és (F.) A 6. nap nem mutatott szaporodó sejteket. Méretjelző sáv: (A, E, F200 'm, (B.) 400 'm, (CD1000 m. A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

3. ábra: A növekvő glomeruláris sejtek a parietális hámsejt marker expresszióját mutatják. Az immunfluoreszcens festést az egyes kapszulázott glomerulusok izolálása után a 6. napon hajtottuk végre a benőtt hámsejtek jellemzése céljából. A parietális hámsejtmarkerekre pozitívan festett kinövő sejtek: (A.) CD44, (B.) SSeCKS és (C.) claudin-1, de nem mutatta (D.) a podocita-specifikus marker synaptopodine vagy (E.) az endoteliális sejtspecifikus CD31 marker, amely kizárólag a glomerulusban található. Méretjelző sáv: (A, B, D, E) 100'm, (C.) 50 'm. A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

4. ábra: A CD44 knockout egerekből izolált glomerulusokban a glomeruláris kinövés károsodott. A kapszulázott glomerulusokat a (A.) WT egerek és (B.) cd44 -/- izolált egerek. Mikroszkópos képeket készítettünk 6 napos tenyésztés után, digitális invertált fénymikroszkóppal. A kinövő parietális hámsejtek száma és a kinövés felülete megnőtt a WT egerek glomerulusaiban a cd44 -/- egerekhez képest, ami arra utal, hogy a CD44 fontos szerepet játszik a parietális hámsejtek aktiválásában. Méretarány: 1000 m. A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

5. ábra: Példa a glomeruláris kinövés felületének elemzésére, mint marker a parietális hámsejtek proliferációjára ImageJ-vel (FIJI). (A.) Egy WT egér kapszulázott glomerulusának glomeruláris kinövése 6 napos tenyésztés után 37 ° C-on. (B.) Először meghatározzuk a skálát a felület mm 2 -ben történő elemzéséhez. Itt: 1 mm = 460 pixel. (C.) A skála beállítása után szelekciós vonal húzódik a glomeruláris kinövés területe körül. (D.) Ezután ezt a kiválasztott területet meg lehet mérni (a felület ebben a példában = 2235 mm 2). Méretarány: 1000 m. A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Az ebben a cikkben leírt protokoll segítségével egyedi kapszulázott glomerulusokat használhatunk a parietális hámsejtek proliferációjának felmérésére, amely a parietális hámsejtek aktivációjának következménye. Ez az ex vivo modell lehetővé teszi számunkra, hogy részletesen tanulmányozzuk a parietális hámsejtek aktiválásában szerepet játszó molekuláris utakat. A leírt módszer a vese disszekciójának és szitálásának egyszerű koncepcióján alapszik a kapszulázott glomerulusok elkülönítésére és tenyésztésére, valamint a parietális hámsejtek proliferációjának és/vagy migrációjának összehasonlítására különböző kísérleti körülmények között. A tenyészetben eltöltött 6 nap elteltével elemezhető eredmények például az egyetlen kapszulázott glomerulus felülete vagy a kinövés átmérője, vagy a kinövő sejtek száma. Ennek a tesztnek egy másik alkalmazása lehet a parietális hámsejtek aktiválásában szerepet játszó molekuláris utakat kiváltó vagy gátló gyógyszerek hatásainak tanulmányozása.

Az immunfluoreszcens festés megerősítette, hogy a kinövő sejtek 6 napos tenyésztés után parietális hámsejtek voltak, mivel pozitívak voltak a parietális hámsejtmarkerek (CD44, claudin-1, SSeCKS) szempontjából, de nem expresszálták sem a podocita-specifikus markert szinaptopodint, sem az endotheliális sejt markert CD31. A festés eredményeivel összhangban, az egyes dekapszulált glomerulusok izolálása és tenyésztése után 6 nappal nem tapasztaltak kinövő sejteket, ami arra utal, hogy a többi glomeruláris sejt szennyezettsége korlátozott a kinövésben ebben a 6 napos periódusban. Egy másik tanulmány a glomeruláris kinövést is elemezte, és kimutatta, hogy a glomeruláris kinövésből származó gyorsan növekvő sejtek valójában parietális hámsejtekből származnak 14.

A kinövő sejtek marker expressziójának elemzésére használt festési protokoll alkalmazható más érdekes molekulákhoz is. Az immunizálást a lemezek üregében végeztük, amelyekben a glomerulusokat 6 napig inkubáltuk. Ezeket a lyukakat az első 2-3 órás inkubálás során nem vontuk be, de a glomerulusokat a lyukakhoz rögzítettük. Az inkubálás üvegbetéteken vagy csúszó kamrarendszeren, amely jobb képalkotást eredményezne, nem volt lehetséges, mivel a glomerulusok nem voltak teljesen rögzítve a felülethez, és a glomeruláris kinövés károsodott. Ezt a specifikus protokollt nemrégiben hozták létre az egészséges WT és cd44 -/- egerekből származó parietális hámsejtek növekedésének vizsgálatára 11. Ezzel a módszerrel kimutatták, hogy a CD44-hiányos parietális hámsejtek proliferációs sebessége csökkent, amit a 4. ábra is bemutat.bemutatásra kerül. Ez a módszer alkalmazható más törzsek egereinél és más genetikailag módosított egereknél is. Például egy korábbi tanulmány hasonló megközelítést alkalmazott a glükokortikoid receptor szignalizáció hatásainak elemzéséhez 15.

Ennek a technikának a használata a glomerulusok egerekből történő izolálására és a sejtes kinövések elemzésére számos előnnyel jár, szemben az állandóan folytatott parietális hámsejtvonalak alkalmazásával a parietális hámsejtek aktiválásában részt vevő utak vagy a Hatással lehet a hámsejtek szaporodására. Kezdetben ez a módszer olyan primer sejteket használ, amelyek közvetlenül a glomerulusból nőnek ki, és csak 6 napig vannak kultúrában. Ezért a glomeruláris kinövésekből származó parietális hámsejtek kevesebb változást tapasztaltak a fenotípusban, mint az örök sejtvonalak, amelyek további növekedési passzusokat igényelnek a 16-os sejtvonal előállításához. Ezenkívül az itt leírt módszer felhasználható a specifikus génkiütések parietális sejtproliferációra gyakorolt ​​hatásának összehasonlítására olyan utak esetében is, amelyeket a csendes sejtnövekedés vagy a GenKnockout hatékonysága miatt nehéz elhallgattatni sejtvonalakba csendesítési módszerekkel.

A protokoll más állatmodellekhez vagy emberi veseszövetekhez való igazításához a sziták méretét a legjobb eredmény érdekében optimalizálni kell. Ennek oka, hogy a glomeruláris méret fajonként eltér, ezért változik azoknak a rostáknak a mérete, amelyekre a glomerulusokat lehet gyűjteni. Fontos továbbá az ép, kapszulázott glomerulusok elkülönítése e módszer céljából. Ezért a glomerulusokat nem szabad összenyomni, hanem óvatosan át kell öblíteni a kisebb szitákon.

A protokoll másik fontos lépése a kapszulázott glomerulusok összegyűjtése szitálás után. Itt fontos a 20% FCS-t tartalmazó táptalaj használata, hogy elkerüljük a glomerulusok egymáshoz való kapcsolódását. Ezenkívül a glomerulusokkal dúsított oldatot közvetlenül át kell vinni az ultra-alacsony tapadású lemezekre, különben a glomerulusok közvetlenül a szokásos sejttenyésztő lemezek felületére, sőt a műanyag csövek felületére is rögzülnek, ami megnehezíti az egyes glomerulusok detektálását és izolálását.

Az egyes kapszulázott glomerulusok összegyűjtése után 3 órán át tenyészteni kell őket a kút közepén lévő kis tápközegben a tapadás érdekében. A képelemzés során az olvasás optimalizálása érdekében a glomerulusok nem úszhatnak a kutak deszkavonalának irányába.

Az itt leírt protokollal a legjobb eredmény elérése érdekében javasoljuk az egyes glomerulusok tenyésztését és a kiolvasást a 6. napon. Ebben az időpontban homogén sejt kinövés figyelhető meg, amely parietális hámsejtekből áll. Később a glomeruláris kinövés fenotípusosan heterogénné válik, ami más sejttípusok növekedésére utal. Ezért úgy tűnik, hogy a protokoll nem alkalmas nagyon hosszú inkubációs időkre. Meg kell jegyezni, hogy a parietális hámsejt kinövések inkubációs ideje fajonként vagy a különböző egér törzsek között változhat. Ezért a tenyésztési időket minden egér törzs vagy faj esetében tesztelni és optimalizálni kell. Ezenkívül a glomeruláris kinövés eredetét mindig ellenőrizni kell a parietális hámsejt-specifikus markerek festésével.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

---