A gyógyszerek térbeli mennyiségi meghatározása tüdő-tuberkulózis elváltozásokban lézeres befogási mikrodisszekcióval
Összegzés
Itt egy protokollt írunk le, amely LC/MS analízissel párosítva lézer befogó mikrodisszekciót használ a pulmonalis tuberculosis granulomákon belüli térbeli gyógyszereloszlások számszerűsítésére. Ez a megközelítés széles körben alkalmazható a szövetek gyógyszerkoncentrációinak nagy térbeli részletességgel történő számszerűsítésére.
Absztrakt
Bevezetés
A gyógyszerszintek térbeli feloldásának és számszerűsítésének képessége elengedhetetlen annak eldöntéséhez, hogy a tuberkulózis elleni gyógyszerek a sterilizációs koncentrációnál eljutnak-e a pulmonalis elváltozásokon belüli bakteriális szubpopulációkba 1. Különösen fontos a gyógyszer behatolása az elváltozás nekrotikus magjába (az úgynevezett caseum), annak meghatározása, hogy melyik rendszerint tartalmazza a legtöbb bacillust és esetleg rosszul hozzáférhető gyógyszereket a vaszkularizáció hiánya miatt.
Az elváltozások behatolásának hagyományos módszerei, amelyek a kivágott tüdőelváltozások homogenizációjának értékelését, majd oldószeres extrakciót és a folyadékkromatográfia-tömegspektrometria (LC/MS) elemzését jelentik, nagyon érzékenyek és szelektívek az érdeklődő gyógyszerek szempontjából. Ezek a módszerek azonban gyenge térinformációt nyújtanak, az eredeti homogenizált szövet méretére korlátozódva. A tömegspektrometrián alapuló képalkotó megközelítések, mint például a mátrix-segített lézeres deszorpciós ionizáció (MALDI) 2, 3, a deszorpciós elektrospray-ionizáció (DESI) 4 vagy a folyadékkal meghosszabbított 5-ös felületű extrakció, nagyon térben megoldott képalkotó képességeket kínálnak, de a közvetlen kvantifikáció rendkívül nehéz lehet vagy lehetetlen az egyes sejtekből vagy szövetekből származó heterogén ioncsökkentő hatások és az analitok eltérő extrakciós hatékonysága miatt 7. Ezenkívül a legtöbb közvetlen szöveti MS képalkotó megközelítés természeténél fogva kevésbé érzékeny, mint az LC/MS, az ionizációért versengő endogén fajok kromatográfiás elválasztásának hiánya és a gyógyszer szövetből történő oldószeres extrakciójának alacsonyabb hatékonysága miatt.
Ez a protokoll leírja az LCM-LC/MS térbeli profilozásának és teljes mennyiségi meghatározásának erőteljes kombinációját, abszolút gyógyszerkoncentrációt kínálva a TB granulomák összes részében. A technika alkalmazható a gyógyszerkoncentrációk meghatározására is sok különböző beteg szövetben, hogy ezáltal segítsék a létfontosságú gyógyszerek felfedezését és fejlesztését.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
Minden állatkísérletet az Országos Egészségügyi Intézet laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó útmutatójának megfelelően hajtottak végre, a NIAID Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának (NIH) engedélyével, Bethesda, MD.
(1) Állatkísérletek és szövetgyűjtés
A protokoll ezen szakasza az állatokkal kapcsolatos eljárásokat és a mintagyűjtés 3. biológiai biztonsági szintjét (BSL3) írja le. A Mycobacterium Tuberculosis Aerosol Infection Procedure and Drug Administration részletes protokolljaihoz a nyulak protokolljait korábban leírták. 11, 12 .
(4) Az LCMS kivonása és elemzése
5. a módszer validálása
- Hozzon létre egy homogenátumot a tüdőszövet-kontrollban 1 rész tüdő, 2 rész PBS és 3-4 acélgyöngy kombinálásával. Verje a tüdőszövetet és a PBS puffert 5 percig 1750 fordulat/perc sebességgel, gyöngy homogenizátorral.
- Tegye a homogenizátumot 10 µl 1 mg/ml etambutol-DMSO-törzs 990 µL-os homogenizátummal való hozzáadásával, hogy 10 000 ng/ml (10 mg/ml) végkoncentrációt hozzon létre, és 1 percig vortexelje.
- Készítsen fagyasztott homogenát blokkot úgy, hogy a homogenátumot egy Cryomoldba öntjük, és gyorsan 5 percig száraz jégen lefagyasztjuk.
- Készítsen elő 25 µm vastag metszeteket a homogenát blokkból a 2.1-2.5. Szakaszban leírtak szerint.
- Bontsa szét a célszövetet a 3.2-3.10. Lépés szerint.
- Adjon 10 µl 1: 1 acetonitrilt/vizet és 2 µL PBS puffert a csövekhez mikrodisszcetált szövetekkel.
- Adjon 50 µL extrakciós oldatot minden csőhöz. Lépések egy standard görbe létrehozására és a gyógyszerkoncentráció meghatározására a 4.9-4.12 szövethomogenát blokkban.
- Számítsa ki az extrakció hatékonyságát a következő képlet segítségével:
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
Az LCM-LC/MS megközelítés áttekintését az 1. ábra mutatjaLátható. Miután a szövetet gamma-besugárzással sterilizálták, minden további lépésre (a szövet levágására) a BSL3 körülmények között kerül sor. 2. ábra mutatja az elváltozás biopszia metszeteit az LCM-től izolált szövet előtt és után. A TB-elváltozások nekrotikus és sejtes területei egyszerűen azonosíthatók és izolálhatók, kizárólag az optikai képek szemrevételezésével (anélkül, hogy a szomszédos szövet szövettanilag festett szakaszaira utalnánk). A boncolási folyamat tiszta metszést hoz létre, a környező szövetek minimális megzavarásával, és az egyes érdekelt régiók 3 millió µm 2 (3 mm 2) elválasztása az elváltozásoktól körülbelül 1 órát vesz igénybe.
LCM-LC/MS kvantifikálást alkalmaztunk térben - számos létező és új anti-TB gyógyszer a pulmonalis elváltozásokon belül. 3A. Ábra MTB-vel fertőzött nyulakból származó mintákat mutat be, amelyek egyensúlyi állapotban etambutolt kaptak. Az LCM-LC/MS lehetővé tette a gyógyszer teljes mennyiségi meghatározását a kazeumban, a sejtes elváltozásban és a fel nem oldott tüdőszöveti területeken belül. Megfigyelték, hogy az EMB behatol az elváltozásba, és eléri a sterilizációs koncentrációt a nekrotikus kazeumban. Az EMB-eladások által a szomszédos szövetektől kapott megfelelő MALDI-MS képet a 3b. Ábra mutatja. A kvalitatív MALDI-MS képek jól korreláltak a kvantitatív LCM-LC/MS adatokkal, amelyeknek alacsonyabb gyógyszerkoncentrációja volt kimutatható a nekrotikus kazeumban a sejtperemhez képest. Az LCM-LC/MS adatait a standard LC/MS módszerrel elemzett szövethomogenátumok közvetlen összehasonlításával validáltuk.
1. ábra : Vázlatos folyamat LCM-LC/MS. Nekrotikus elváltozással rendelkező nyuszi tüdőbiopsziákat és a környező nem érintett tüdőket összegyűjtjük és lefagyasztjuk. A kriosekciókat vékony PET-membránokra vágjuk, és a nem érintett tüdő-, sejt- és kazeózus elváltozásokat boncoljuk és izoláljuk számszerűsítés céljából LC/MS segítségével. adaptálva Zimmerman et al. 12 Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
2. ábra : Lézió (A, B) és nem érintett tüdő (C, D), amint a mikroszkóp alatt megjelennek (A, C) és (B, D) mikrodisszekció előtt. A Caseosa lézióterületek sötétebbnek és "repedezettebbnek" tűnnek az optikai képolvasásban (A, zöld körvonal). A sejtes elváltozás világosabb színű és szilárdabb szerkezetű (A, piros szegéllyel). A be nem oldott tüdőt legalább 5 mm-re meg kell tapintani az elváltozás határától, és vörös/rózsaszínűnek kell lennie (C, cián körvonal). Méretezési sávok (fekete, kék és lila) = 400 µm. Ne feledje, hogy csak a nem érintett tüdő területeit szabad megválasztani, hogy elkerüljék a szövet teljes felületén megfogott alveoláris tereket és bronchiolákat (lásd d). Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
| Bontott terület (µm-2) | Mért EMB koncentráció (Ng/g) (n = 3) | EMB visszanyerés (%) (n = 3) |
| 3 millió | 10633 (± 404) | 106 (± 4) |
| 5 millió | 10057 (± 1132) | 101 (± 11) |
| 10 millió | 10563 (± 1128) | 105 (± 11) |
Asztal 1: Az LC-LC/MS módszer extrakciós hatékonysága az EMB mennyiségének meghatározására a tüdőben. Az EMB teljes helyreállítása a boncolt tüdőszövet EMB-adalékolt homogenizátumát rögzítette az összes értékelt szövetmennyiségre vonatkozóan.
| Nyúl azonosítója | LC/MS EMB (ng/g) | LCM-LC/MS EMB (ng/g) | Különbség (%) |
| 899 | 2910 | 3320 | 14-én |
| 904 | 2010 | 1870 | -7. |
| 911 | 2150 | 2370 | 9. |
2. táblázat: Három adagolt nyúl bevonatlan tüdőbiopsziájának EMB-mennyiségi összehasonlítása LCM-LC/MS alkalmazásával. és LC/MS A módszerekkel kimutatott egyenértékű gyógyszerkoncentráció, és az LCM-LC/MS folyamat során nem észleltek bomlás vagy aspiráció során bekövetkező jelveszteséget.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
A pulmonalis tuberkulózisos elváltozásokon belül a gyógyszerek térbeli felbontású meghatározása szükséges annak megállapításához, hogy a gyógyszer expozíciója eléri-e a különbözõ elváltozásrészekben lévõ baktérium populációk sterilizáló koncentrációját. Az itt leírt LCM-LC/MS módszer lehetővé teszi az anti-TB gyógyszerek abszolút kvantifikálását az elváltozás minden alanyában, beleértve a baktériumokban gazdag kazeumot is, összesen csak 1-3 szövetmetszettel. A hagyományos szöveti homogenizálás és az LC/MS megközelítései a gyógyszer mennyiségi meghatározására a szövetekben gyakran hiányzik a térbeli jellemzőkből, hogy kezeljék a specifikus elváltozások rekeszeit, és még akkor is, ha ez lehetséges, a kézi extrakció során jelentős a keresztsejt-szennyeződés és a nekrotikus elváltozások területe.
A szövetfestési protokollokat általában az LCM előtt alkalmazzák proteomikai alkalmazásokhoz, hogy lehetővé tegyék a szöveti területek és a sejtpopulációkban elhelyezkedő területek könnyű azonosítását. Rutin hisztokémiai foltok, mint pl B. A H&E nem kompatibilis a gyógyszer mennyiségi meghatározásával, mert sok oldószeres mosási lépés a gyógyszert a szövetrészről a másikra vinné. A szomszédos vakok H&E-vel festhetők és felhasználhatók a mikrodisszekció útmutatójaként. Erre azonban általában nincs szükség, mivel az elváltozások rekeszei megtekinthetők a standard LCM Brightfield mikroszkóp alatt (2. ábra) megoldható.
A vágás és a mikrodisszekció optimalizálása kritikus fontosságú a lézió sikeres kvantifikálásához. A módszer kidolgozása során két különböző membránanyagot, a polietilén-tereftalátot (PET) és a polietilén-naftalátot (PEN) értékeltünk, mint szubsztrátumot a szövetrészeknek a mikrodisszekcióhoz való összeállításához. A PEN membránok megnövekedett statikus töltést szenvedtek el a PET membránokhoz képest, és az összes boncolt szövetterület körülbelül 30% -a elveszett a membrán és a boncolt szövetrész közötti statikus vonzerő miatt. Ezért a megfigyelt jelentősen csökkent statikus vonzerő miatt a PET-membránokat választották ki a későbbi boncolásokhoz (a PET-membránokból kivágott régióknak csak az 5% -a veszett el az LCM során).
A boncolt szöveti régiók sűrűsége szintén fontos szempont a gyógyszerszint mennyiségi meghatározásakor a szöveti terület vagy térfogat alapján. Ez különös jelentőséggel bír a tüdő- és lézióbiopsziák esetében, amelyekben a nem érintett tüdőszöveti területek összességében alacsonyabb sűrűségűek, mint a sejtek és a kazeum (kevesebb olyan szövet van, amelyek relatív területe azonos) több nyitott hörgő és alveoláris tér jelenléte miatt. Ennek a sűrűségbeli különbségnek a hatását enyhíteni lehet, ha alaposan körülnézünk a nyitott területeken, beleértve azokat az összegyűjtött szövetek felhalmozódott területén is (a 2. ábra szerint)Látható).
További korlátozás, hogy a bemutatott LCM-LC/MS módszer csak az izolált szövet teljes mennyiségét számszerűsíti (az összes szöveti homogenizálással, az oldószeres extrakcióval és az LC/MS kvantifikációs megközelítéssel együtt), és nem oldja fel a fehérjéhez kötött gyógyszer-koncentrációkat a meg nem kötött törésekből. A mikrodialízis alternatív megközelítés a szövetben lévő meg nem kötött gyógyszer mennyiségének meghatározásához, és lehetővé teszi a szabad gyógyszerkoncentrációk pontos számszerűsítését a baktériumok extracelluláris populációit elérve 13. A technikát azonban legjobban kiegészítő megközelítésként lehetne alkalmazni, mivel hiányzik az LCM-LC/MS térspecifikus jellemzői, és csak az extracelluláris szövetfolyadék hierarchiájában számszerűsíti az oldható gyógyszer szintjét, nem az intracelluláris tartalmat.
Először kombináltuk az LCM-et és az LC/MS-t az antibiotikumok térbeli mennyiségi meghatározásához a tuberkulózis fertőzés helyén. A módszertan rendkívül hatékony, mivel bármely kismolekulájú gyógyszerre alkalmazható bármely betegség stádiumában. Valójában nemrégiben számszerűsítettünk egy gombaellenes gyógyszerjelöltet a hasi candidiasis egérmodelljében14. A gyógyszerek differenciális felosztása heterogén daganatos rekeszekbe (beleértve a nekrotikus magokat is) a rák kezelésében komoly aggodalomra ad okot, és a rákos gyógyszerek felfedezésének kritikus területe 15. Az LCM-LC/MS ideálisan alkalmas e kérdések megválaszolására. Ezenkívül az LCM-LC/MS hasznos a biomarkerek felfedezéséhez a szöveti régiókban és a sejtpopulációkban a betegség patogenezise során bekövetkező metabolikus, lipidomikus és proteomikus változások számszerűsítésére.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.