A hematológiára, az onkológiára és a tumorimmunológiára összpontosító orvosi klinikáról - PDF
Az Egészségügyi Kar hematológiájára, onkológiájára és tumorimmunológiájára összpontosító Orvosi Klinikától Charité Universitätsmedizin Berlin ÉRTEKEZÉS Onkogén által kiváltott öregedés a colorectalis adenoma-carcinoma szekvenciában és az 5-FU-ra adott válasz előrejelzőjeként az elsődleges áttétes helyzetben tudományos fokozat Doctor medicinae (Dr. med.) Anja Haugstetter, Stuttgart-Bad Cannstatt-tól az Orvostudományi Karon Charité Universitätsmedizin Berlinben
Lektor: 1. Prof. Dr. med. C. A. Schmitt 2. Prof. Dr. med. F. R. Greten 3. Prof. Dr. med. L. Zender PhD időpontja: 2011. november 18
Tartalom 1 Bevezetés 6 1.1 Kolorektális adenokarcinóma 6 1.1.1 A kolorektális adenokarcinóma epidemiológiája 6 1.1.2 A colorectalis carcinoma kialakulásának kockázati tényezői 6 1.1.3 Prognosztikailag releváns faktorok 7 1.1.4 Adenoma carcinoma szekvencia 8 1.1.5 Az onkogén ras 10 6 A colorectalis adenokarcinóma terápiája 11 1.2 Apoptózis 11 1.3 Szenzencia 12 1.3.1 Az öregedés jellemzői 13 1.3.2 Az öregedés lehetséges markerei 15 1.3.3 Az onkogén által kiváltott öregedés jelentősége in vivo 18 1.3.4 Korai öregedés és kemoterápiás szerek 19 2 Kutatási kérdés 22 3 Anyag és módszerek 23 3.1 Anyag 23 3.1.1 Sejtvonalak és baktériumvonal 23 3.1.2 Táptalaj 23 3.1.3 Oldatok 24 3.1.4 Plazmák 25 3.1.5 Eszközök és kiegészítők 25 3.1.6 Antitestek 27 3
3.2 Módszerek 28 3.2.1 Sejtkultúra 29 3.2.1.1 Sejtvonalak 29 3.2.1.2 A sejtvonalak szubkultúrázása 30 3.2.1.3 A sejtek krioprezerválása 30 3.2.1.4 Sejtszám, növekedési görbék, életképesség 30 3.2.2 Retrovirális fertőzés 31 3.2.2.1 Használt plazmidok 31 3.2. 2.1 Transzformáció 31 3.2.2.2 A DNS minikészítése 32 3.2.2.3 A DNS maxikészítése 33 3.2.2.4 A DNS-oldat koncentrációjának fotometriai meghatározása 33 3.2.2.5 A DNS-fragmensek elektroforetikus elválasztása 34 3.2.2.6 Transzdukció 34 3.2. 2.6.1 Kalcium-foszfát-közvetített transzfekció 34 3.2.2.6.2 A célsejtek fertőzése 35 3.2.3 A kontrollok rögzítése és paraffinba ágyazása 35 3.2.4 Festési módszerek 37 3.2.4.1 Immunhisztokémia 37 3.2.4.2 Az SAHF fluoreszcens festése 39 3.2.4.3 SA-béta-Gal - Festés 39 3.2.4.4 A szövetfestés értékelése 40 3.2.5 Áramlási citometriás mérések: BrdU-PI profil 40 3.2.6 A betegek kiválasztása és a nyomon követési adatok 41 3.2.7 K-ras onkogén mutációs vizsgálat 42 3.2.8 Statisztika 42 4
4 Eredmények 43 4.1 Szeneszcencia kontrollok előállítása fibroblasztokból 43 4.2 Szenszcencia kriogén szövetekben 47 4.3 Szenszencia paraffin szövetekben 53 4.4 Klinikai relevancia értékelése 65 5 Beszélgetés 73 5.1 Összehasonlítás a jelenlegi irodalommal 74 5.2 Kritikai megjegyzések 80 5.3 Kitekintés 81 6 Összefoglalás 83 7 Függelék 7.1 7.1 Irodalomjegyzék 85 7.2 A 95. ábra felsorolása 7.3 A táblázatok 96 listája
A DNS károsodásának megindulása, amelyre a sejt öregedéssel reagál, a premalignus tumor megáll a növekedésében. A szövet megvédheti magát a rosszindulatú daganattól való progressziótól. 5. ábra: A terápia által kiváltott öregedés. Az öregedés szerepe premalignus és malignus daganatokban. Az onkogén aktiváció normál sejtekben kezdeti hiperproliferációhoz vezet. Az ebből eredő DNS-károsodás aktiválja a tumor szuppresszor programot, amely megakadályozza a premalignus tumor növekedését. Az öregedés tipikus jellemzői találhatók. Ha olyan mutáció következik be, amely kikapcsolja a tumor szuppresszor programját, vagy alternatívaként csökkenhet az öregedést elősegítő kísérő tényezők száma, a tumor újra növekedni kezd, és kialakul az invazív rosszindulatú daganat. Ha a rosszindulatú daganatot kemoterápiás szerekkel kezelik, ha reagál, a sejt öngyilkossági apoptózisához vagy ismét a terminális sejtciklus leállási öregedéséhez vezet. Hogy pontosan mi történik molekuláris biológiai értelemben a premalignus tumor karcinómává fejlődése során, nem világos. Egyrészt elképzelhető lenne a 20 effektor mutációja
Az öregedési gépezet jelútjának elindítása, pl. p53 mutáció, amellyel a premalignus tumor kontrollálatlan módon invazív módon szaporodni kezd. Egy alternatív modell a premalignus elváltozás öregedését az onkogén aktivitás kifejeződésének tekinti más öregedést elősegítő tényezőkkel együtt. Ezek a tényezők magukban foglalhatják a sejt autonóm és esetleg lokális nem sejt autonóm állapotokat, mint pl. vaszkuláris sűrűség, hipoxia jelenléte és a makrofágok által kiválasztott citokinek. Az invazív karcinóma kialakulását ezután az alacsonyabb pro-seneszcens nyomás magyarázza, amely lehetővé teszi az OIS leküzdését. Döntő különbség ebben a modellben az, hogy a sejtek genetikailag képesek öregedni. A kialakult rosszindulatú daganatban még mindig lehet néhány kis öregedő terület. Ha most kemoterápiás szerekkel kezelik, a daganat vagy öregedésben újra leállhat, vagy apoptózisba léphet, ha a terápiára válasz érkezik. 21.
Anyag és módszerek 3 Anyag és módszerek 3.1 Anyag A laboratóriumi vegyszereket a Merck (Németország), a Biochrom (Németország), a Sigma (Németország), a Roth (Németország), a Serva Electrophoresis (Németország), a New England Biolabs (Németország), a DAKO (Dánia) és a Németország szállította. A Gibco (USA) a legmagasabb színvonalon szerezte be. Eszközöket és kiegészítőket, valamint sejttenyésztési anyagokat a Falcon (Németország), az Eppendorf (Németország), a Nunc (Németország) és a Techno Plastic Products (Svájc) cégektől szereztek be steril eldobható tárgyakként. Az újrafelhasználható anyagokat autoklávozták. Más gyártók vegyi anyagait és anyagait az alábbi lista mutatja. 3.1.1 Sejtvonalak és baktériumvonal IMR90 American Type Culture Collection (ATCC), USA (CCl-186) adherens diploid emberi tüdő fibroblasztok egy 16 hetes magzatból Phoenix eco Nolan Lab, USA 135 tapadó emberi embrionális vese sejtvonal 293T E. coli (DH5α) Invitrogen, Németország 3.1.2 Táptalaj sejttenyésztéshez (4 ° C-on tárolandó) 4 ° C-on tároljuk) FBS (borjúmagzati szérum) + 10% DMSO Lysogeny húsleves (LB) táptalaj
Anyag és módszerek 3.1.3. Oldatok PBS (foszfáttal pufferolt sóoldat) (szobahőmérsékleten tárolva) 8 g NaCl (137 mm) + 0,2 g KCl (2,7 mm) + 1,44 g Na 2 HPO 4 (10 nm ) + 0,24 g KH2P04 (2 mm) töltsön fel 800 ml-ig dh20-val; titráljuk pH-ra 7,4 - 1 l, töltsünk fel dh 2 O S1 oldatot (mini készítmény) (4 ° C-on tároljuk) 50 mm glükóz + 25 mm Tris-HCl (ph 8,0) + 10 mm EDTA (ph 8, 0) dh 2 O-ban P1 oldat (mini készítmény) (4 ° C-on tárolandó) S1 oldat + 100 µl/ml RNáz A-t adunk hozzá minden esetben frissen S2 oldatot (mini készítmény) (szobahőmérsékleten tároljuk) 0,2 N NaOH + 1% SDS azaz 2 O-ban minden egyes alkalommal frissen elkészítjük az S3 oldatot (mini-készítmény) (4 ° C-on tároljuk) 60 ml 5 M kálium-acetát + 11,5 ml ecetsav + 28,5 ml azaz 2 O 50 x TAE (szobahőmérsékleten tárolva) 242 g Trisbase + 57,1 ml jégecet + 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) SA-béta-Gal-PBS (szobahőmérsékleten tárolva) PBS + 1 mm MgCl 2 pH 6-ra titrálva emberi szövetekhez SA-béta-Gal fixáló SA-béta-Gal-PBS + 2% paraformaldehid + 0,25% glutáraldehid 24
Anyag és módszerek X-Gal oldat SA-béta-Gal-PBS + 1 mg/ml 5-bróm-4-klór-3-indolil-ß-D-galaktozid + 50 µl/ml 20 x kálium-cianid oldat 20 x kálium-cianid oldat ( 4 C) 820 mg K 3 Fe (CN) 6 + 1,050 g K 4 Fe (CN) 6 x 3h 2 0, töltsön fel 25 ml-re PBS Mowiol 4-88-al (az alikvot részeket -20 C-on tartsa, használat előtt előmelegítse 37 C-ra) ) Keverjünk össze 8 g Mowiol + 40 ml 0,2 M Tris-HCl-t (pH 8,5) 50-60 C-on; Hűtés után: +20 ml glicerin + 2,5% DABCO QIAamp DNS Mini Kit Quiagen, Németország BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit 3130 Genetic Analyzer, Biosystems, USA 3.1.4 Plazmidok Plasmid gerincbetét Origin pbabe-ras pbabe-puro H-rasV12 Scott Lowe pbabe-empty pbabe-puro - Scott Lowe 3.1.5 Eszközök és kiegészítők BioPhotometer 8,5 mm Eppendorf, Németország Áramlási citométer (fluoreszcenciával aktivált sejtek válogatása, FACS) FACSCalibur Becton Dickinson, Németország Beágyazó készülék EG1160 Leica, Németország 25
Anyagok és módszerek Elektroforézis Tápegység E835 Consort, Belgium Víztelenítő készülék ASP300 Leica, Németország Inkubátor Steri-cult 200 Labotect GmbH, Németország Invisorb Plasmid Maxikit Invitek, Németország Camera Inteq, Németország Kryostat FrigoCut 2800 Reicher-Jung, Németország Microtom RM2035 Leica, Németország Mikroszkóp Krüss, Németország Mikroszkóp fluoreszcencia festéshez Zeiss Axioplan Mr. Frosty fagyasztó doboz (1 C percenként) Nalgene Labware Neubauer számláló kamra mélysége 0,1 mm-es parafinkazetta Superior Marienfeld, Németország Medite, Németország Steril bank Kendro HeraSafe Heraeus, Németország Nitrogéntartály Thermolyne 6Plus Locator Thermo Scientific Thermomixer kényelem 1,5 ml Eppendorf, Németország Fűtőszekrény Function Line Heraeus, Németország Centrifuga Eppendorf 5417 R Eppendorf, Németország Centrifuga Heraeus Megafuge 1,0 R Heraeus, Németország 26
Anyag és módszerek 3.1.6 Antitest antigén eredet A vállalat hasított kaszpáz 3/Asp175 nyúlsejt jelző technológia, USA (# 9661) H3K9me 3 nyúl Abcam, USA (ab8898) HP1 γ egér Chemicon, USA (MAB3450) Ki67 egér DAKO, Dánia (M7240) ) P16 egér Novocastra, Egyesült Királyság (NCL-p16-432) P53 egér onkogén, Németország (OP43, AB-6) PAI-1 egér Novocastra, Egyesült Királyság (Ncl-PAI-1) Phospho-Chk2 (Thr68) nyúlsejt-jelző technológia, USA (# 2661) Phospho-Erk 1/2 (Thr202/Tyr204) Nyúlsejt-jelző technológia, USA (# 4376) Phospho-H2A.x (Ser139) Nyúlsejt-jelző technológia, USA (# 2577) Phospho-P53 (Ser15) Nyúlsejt-jelző technológia, USA (# 9284) PML egér DAKO, Dánia (M7202) Fluoreszkáló másodlagos antitestek Egérellenes IgG kecske GIBCO Invitrogen, Németország, (Alexa Fluor 594; A21121) Fluoreszcens BrdU-ellenes egér GIBCO Invitrogen, Németország (MD5300) ) Nyúlellenes második antitestek Donkey Dianova, Németország LSAB-AP Kit Dako, Dánia (K0689) LSAB-HRP Kit Dako, Dánia (K0690) 27
Anyag és módszerek 3.2 Módszerek A 6. ábra áttekintést nyújt a kísérleti beállításokról és az egyes lépések ütemezéséről 6. ábra: A módszer áttekintése. A kísérletek egyes lépéseinek áttekintése. A lépés: Kontrollok előállítása az öregedő fenotípushoz IMR90 fibroblasztokból. Az IMR90-ket retrovirálisan fertőztük rasszal vagy üres vektorral. A szelekció befejezése után hat napig kultúrában hagyták őket. Ez alatt az idő alatt az IMR90ras fenotípusa megjelent, míg az IMR90empty tovább szaporodott. Különböző öregedési teszteket hajtottak végre, például növekedési görbéket, SA-béta-Gal vizsgálatot és sejtciklus elemzést. A fertőzött sejteket sokkosan fagyasztottuk le, mint kriokontrollos sejtpelletek, vagy dehidratáltuk a paraffin-kontrollokhoz, és paraffinba ágyazottuk. B lépés: IMR90 kriokontrollokat és vastagbél-kriogén szöveteket (5 normál szövet, 12 adenoma, 6 karcinóma) vizsgáltunk az öregedés szempontjából az SA-béta-Gal vizsgálattal és a Ki67 immunhisztokémiai kimutatásával. C lépés: IMR90 paraffin 28