A kalória-korlátozás hatása a bélpermeabilitásra, a gyulladásos markerekre és a székletre
alanyok
absztrakt
bevezetés
Annak a megfigyelésnek az alapján, hogy az elhízás krónikus, erősen gyulladásos állapothoz és esetleg károsodott béláteresztő képességhez kapcsolódik 7, a jelen tanulmány célja annak megvizsgálása volt, hogy a kalória-korlátozás képes-e módosítani a bélpermeabilitást és ezáltal csökkenteni az emberek gyulladásának markereit. Ezenkívül megvizsgálták a bél mikrobiota sokféleségét és összetételét, valamint azok lehetséges kapcsolatát a bél permeabilitásával és gyulladásával.
Eredmények
A csökkentett kalóriatartalmú étrend fogyást eredményezett
Húsz nő (átlagéletkor 46, 8 ± 11, 5) vett részt a vizsgálatban, és egyetlen résztvevő sem esett ki. A résztvevők fizikai és biokémiai jellemzőit a beavatkozás előtt, közvetlenül a hipokalorikus étrend után és 14 nappal a beavatkozás után az 1. táblázat mutatja. A résztvevőket diétára (800 kcal/nap) és további 200 g zöldségfélék fogyasztására kérték. Az eredeti 1698, 1 ± 592, 7 kcal/nap kalóriabevitelhez képest ez a beavatkozás jelentős energiahiányt okozott (P 23, 24, a kalória korlátozás után szignifikáns csökkenést mutatott (P 25. A vizsgálat kezdetén a plazmakoncentráció egy 4 hetes hipokaloros beavatkozás után jelentősen megnőtt) (P
( a - d ) Box diagramok 18 résztvevő zsírszöveti biopsziájának ciklusküszöbértékei (CT) alapján a 4 hetes kalóriakorlátozás előtt és után. ( e ) A zsírsejt-átmérőkről 8 résztvevő adatai álltak rendelkezésre. *** P 2 és 4020 ± 773 μm 2-re csökkent (n = 8, P = 0,31).
A beavatkozások egyéni változásokat váltottak ki a széklet mikrobiota profiljában
A kalóriacsökkentés és a fogyás megkülönböztetéséhez megvizsgáltuk a résztvevőket, miután két egymást követő héten visszatértünk a kiegyensúlyozott súlymegtartó étrendbe. Az adatok arra utalnak, hogy az alacsony kalóriatartalmú étrend során észlelt változások többsége eltűnt, ami arra utal, hogy ezek a változások elsősorban az akut és mély kalóriakorlátozásnak, nem pedig a résztvevők által tapasztalt mérsékelt testtömeg-csökkenésnek köszönhetők. a követés két hete alatt nem hízott jelentősen.
A várakozásoknak megfelelően a hsCRP gyulladásos marker plazmakoncentrációja csökkent a VLCD után, ami összhangban áll az irodalommal 28. Megmértük a keringő LBP-t is, mint helyettesítő markert a sejtfal-komponensek transzlokációjára Gram-negatív baktériumokról, ezt a kifejezést szivárgó bél-asszociált endotoxémiának hívják. A kalóriacsökkentés meglehetősen szerény csökkenést eredményezett az LPB 29-es szintjén, ami összhangban van a bélpermeabilitási mérések eredményeivel és a gyulladásos markerek esetleges csökkenésével. A tanulmányterv azonban nem teszi lehetővé egyértelmű következtetések levonását az endotoxin transzlokáció és a szisztémás gyulladás közötti lehetséges ok-okozati összefüggésről.
A plazma leptin szintje szignifikánsan csökkent, míg a HMW adiponectin a beavatkozás után emelkedett. Ezzel szemben az MCP-1 szintek változatlanok maradtak. Az egyik magyarázat az lehet, hogy az átlagos 7% -os súlycsökkenés túl kicsi ahhoz, hogy nagyobb hatást gyakoroljon az elhízással kapcsolatos gyulladásjelzőkre 30. Ezenkívül a kiválasztott markerek zsírszövetben történő génexpressziójának változásai - a leptin kivételével - valószínűleg csekélyek voltak a korlátozott fogyás miatt. A jelentős súlycsökkenés ellenére a hasi bőr alatti zsírszövet zsírsejtméretének jelentős csökkenését nem figyelték meg. Van azonban tendencia az átlagos adipocita méret csökkenésére. Verhoef és mtsai. kimutatta, hogy a 10% -os súlycsökkenés a 31 adipocita méret jelentős csökkenését okozta .
A beavatkozáshoz egy-egy OTU megnövekedett előfordulása is társult a Ruminococcus és a Bifidobacterium nemzetségben, amely magában foglalta mind a komplex poliszacharidok, mind a gazdaszervezetből származó poliszacharidok élelmiszer-lebontási termékeit 40. Santacruz és mtsai. a Bifidobacterium spp. qPCR-számának növekedését is kimutatta. fogyás (-6,9 kg) után elhízott serdülőknél 10 hét kalóriacsökkentés után 41 .
Vizsgálatunk erőssége a résztvevők szigorú szabványosításában és átfogó fenotipizálásában rejlik. Ezenkívül a VLCD bélpermeabilitásra gyakorolt hatásának jellemzésére különféle módszerek széles skáláját alkalmazták: A metabolikus állapotot oGTT-vel értékelték; A gyulladás állapotát különféle keringő paraméterek és gén expresszió segítségével vizsgálták a zsírszövet mintákban. Az eredményeket a bél mikrobiotájára vonatkozó adatok is alátámasztották, amelyek egyedi mintát követtek. További vizsgálatokra van szükség e heterogén válaszok jobb megértéséhez.
Összegzésként elmondhatjuk, hogy adataink arra utalnak, hogy a 4 hetes VLCD-étrend jótékony hatással van az elhízott nők bélsorompójára, amely a normál étrendhez való visszatérés után gyorsan eltűnik. A bélpermeabilitás változásainak és a metabolikus és gyulladásos biomarkerekben, valamint bizonyos célbaktériumokban megfigyelt változások közötti lehetséges ok-okozati összefüggés további vizsgálatot igényel.
Résztvevők és módszerek
A vizsgálati protokollt a Müncheni Műszaki Egyetem Orvostudományi Karának etikai bizottsága ellenőrizte és jóváhagyta (jóváhagyási szám: 5499/12). A tanulmány a jó klinikai gyakorlat harmonizációjáról szóló nemzetközi konferencia és a Helsinki Nyilatkozat (a felülvizsgált változatban, Szöul, Dél-Korea, 2008) irányelvein alapult. A vizsgálatba való felvételt megelőzően minden résztvevő írásos beleegyező nyilatkozatot kapott. A tanulmány bekerült a német tesztnyilvántartásba (DRKS00006210). A német tesztnyilvántartás regisztrációjának dátuma 2014. június 11 volt.
A tanulmány résztvevői
Húsz résztvevőt vettek fel, akiknek BMI-értéke ≥ 30 kg/m² volt, 2013 októberében München környékén hirdetések útján. A részvételre való jogosultságot a kórelőzmény részleteit tartalmazó részletes szűrő kérdőív segítségével értékelték. A kizárási kritériumok a következők voltak: BMI
Dizájnt tanulni. A séma áttekintést nyújt az ütemtervről és az elvégzett különféle vizsgálatokról. Rövidítések: BS, vérminta; FB, zsírbiopszia; FS, székletminta; GP, béláteresztő képesség; IC, közvetett kalorimetria; MRI, mágneses rezonancia képalkotás; NC, táplálkozási tanácsok; Testnevelés, fizikai vizsga; oGTT, orális glükóz tolerancia teszt; kérdőív.
Fogyókúra protokollok
A vizsgálat résztvevőit arra utasították, hogy rögzítsék az élelmiszer-fogyasztásukat a vizsgálati időszak során. A diéták energiatartalmát és makroelem-összetételét az OptiDiet Plus szoftverrel számoltuk (5.1.2.046 verzió, GOE mbH, Linden, Németország).
Antropometriai mérések
Az antropometriai és klinikai méréseket 8 és 9 óra között standardizálták egy éjszakai böjt után. A testtömeget és az összetételt a TANITA BC-418 MA III típusú testösszetétel-analizátorral (Amszterdam, Hollandia) mértük. A nyugalmi anyagcserét (RMR) lombkoronával mértük (COSMED Quark RMR, Fridolfing, Németország).
Vérminták és biokémiai elemzés
Böjt közben vérmintákat vettek. A lipid paramétereket (összkoleszterin, LDL-c, HDL-c, trigliceridek), a májenzimeket (aszpartát-transzamináz (AST), alanin-transzamináz (ALT), γ-glutamil-transzferáz (γ-GT)), a kreatinint, a húgysavat és az éhomi glükózt a SynLab (München, Németország) határozta meg. elemezni. További vérmintát vettünk, azonnal centrifugáltuk (2500 g 10 percig 20 ° C-on), majd -80 ° C-on tároltuk az elemzésig. Leptin, Chemerin, hsCRP, RANTES, MCP-1, HMW-Adiponektin és LBP (mindegyik: K + F, Wiesbaden, Németország), inzulin (Dako, Glostrup, Dánia) és zonulin (Immundiagnostik AG, Bensheim, Németország) kereskedelmi forgalomban kapható enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatok (ELISA) segítségével vizsgálják. A fekális kalprotektint ELISA-val (CALPROLAB ™ Calprotectin ELISA (HRP), FROST Diagnostika GmbH, Otterstadt, Németország) mértük. Minden ELISA-t a gyártók által leírt módon hajtottunk végre. A NEFA-t kereskedelmi tesztkészlettel (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Németország) mértük. Az inzulinrezisztenciát a HOMA-IR alkalmazásával becsültük meg [HOMA-IR = inzulin (μU/ml) × glükóz (mmol/l)/22, 5] 42.
Orális glükóz tolerancia teszt
Az orális glükóz-tolerancia tesztek (OGTT) 8 és 9 óra között kezdődtek 12 órás éjszakai böjt után. Az alap vérminta vétele után az alanyok 75 g glükózt kaptak 300 ml térfogatban (AccuCheck®-OGT, Roche, Mannheim, Németország). 30, 60 és 120 perc múlva vért vettünk és meghatároztuk a glükózszintet (HemoCue Glucose 201 +, plazmakalibrált, Ängelholm, Svédország).
Béláteresztő képesség
Az obstruktív bélműködést különféle nem invazív tesztek segítségével értékelték. Először validált cukorabszorpciós teszt és PEG-teszt segítségével mértük a bélpermeabilitást. Mindkét tesztet párhuzamosan hajtották végre. Az elv az, hogy mérjük a különböző molekulatömegű orálisan beadott anyagok vizelettel történő kiválasztását. A vizsgálatokat közvetlenül az eljárás előtt, az eljárás után és két héttel az eljárás után hajtották végre. Az adatokat a bevitt cukor százalékában és a vizeletben talált PEG-k százalékában mutatjuk be. Ezeket az értékeket a vizelet-visszanyerés% -ának nevezzük. Végül a bélpermeabilitási marker zonulint mértük a vérben ELISA alkalmazásával.
Cukor felszívódási teszt
A cukorabszorpciós tesztet Norman és mtsai. 43. A cukrokat nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával pulzáló elektrokémiai detektálással számszerűsítettük (kromatográfiai modul: 250, Dionex, Idstein, Németország) 43.
Polietilénglikol abszorpciós teszt
A résztvevők 100 ml PEG tesztoldatot kaptak, 1 mg molekulatömegű (Mr) 400 (PEG 6-PEG 13; tömegtartomány: 285-678 Da), 200 mg Mr 1500 (PEG 20-PEG 45; tömeg) tartományban: 899-2000. Da), 4 g Mr 3000 (PEG 51-PEG 90; tömegtartomány: 2 264-3 982 Da) és 4 g Mr 4000 (PEG 75-PEG 115: tömegtartomány: 3 322-5 084 Da) (Merck Darmstadt, Németország). Öt órával a cukorteszt oldat bevétele után a PEG tesztoldatot megitták, és a vizeletmintákat a következő 24 órában vették. A PEG-ket folyadékkromatográfia-tömegspektrometriával elemeztük, Lichtenegger és Rychlik 44 leírása szerint. .
Hasi szubkután zsírszövet biopszia
A hasi szubkután zsírszövet mintákat tűszívással nyertük a tápszert tartalmazó étrend előtt és után. Krebs-Ringer pufferben végzett mosás után a zsírszövetet csövekre osztottuk, amelyek sterilizált cirkónium-dioxid üveggyöngyöket (Carl Roth, Karlsruhe, Németország), RLT puffert (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Hilden, Németország) és 1% (v/v) tartalmúak voltak. ) β-merkaptoetanolt (# M3148, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), majd azonnal lefagyasztják és -80 ° C-on tárolják. A zsírszövettan szempontjából a zsírszövetet 4% pufferelt formalinban (pH 7,4) rögzítettük 24 órán át, végül paraffinba ágyazva szobahőmérsékleten tároltuk az elemzésig. Az adipociták méretét a cellprofiler® nyílt forráskódú képelemző szoftver segítségével határozták meg (http://www.cellprofiler.org/).
Kvantitatív polimeráz láncreakció
Székletminták
A székletmintákat közvetlenül steril műanyag tartályokban (1000 ml; VWR International, München, Németország) gyűjtöttük. A résztvevőket ezután arra kérték, hogy gyűjtsenek műanyag kanalat a széklet egyik pontjáról egy székletgyűjtő csőbe 8 ml DNS-stabilizáló pufferrel (Stratec Molecular GmbH, Berlin, Németország). A székletmintákat ezután -18 ° C-on azonnal lefagyasztották a következő látogatásig. A résztvevők a fagyasztott székletmintákat hűtőegységek segítségével szállították a laboratóriumba. Végül a gyűjtőcsöveket azonnal -80 ° C-on tároltuk.
16 Nagy teljesítményű S-riboszomális RNS gén amplikon szekvenálás
A mintákat a korábban leírt módon dolgoztuk fel 48. Röviden, a sejteket gyöngyözéssel és hőkezeléssel lizáltuk, és a metagenomikus DNS-t gDNS oszlopok segítségével tisztítottuk (Macherey-Nagel, Düren, Németország). A koncentrációkat és a tisztaságot a NanoDrop® rendszerrel (Thermo Scientific Waltham, Massachusetts, USA) ellenőriztük. A 16 S-riboszomális RNS (rRNS) gén V3/V4 régióját 24 ng DNS-ből amplifikáltuk 341 F és 785 R 49 primerek alkalmazásával (25 ciklus). Tisztítás után (AMPure XP rendszer, Beckmann Coulter Biomedical GmbH) és ekvimoláris mennyiségben összegyűjtve a 16 S-rRNS gén amplikon páros végű módban (PE275) volt MiSeq rendszer (Illumina, Inc., San Diego, USA) segítségével. Kalifornia, USA). USA) a gyártó utasításai szerint és a végső DNS-koncentráció 10 pM és 15% (v/v) PhiX standard könyvtár.
Szekvenciaelemzés
A nyers olvasott fájlokat az UPARSE 50 megközelítés alapján dolgozták fel az IMNGS 51 alkalmazásával. A szekvenciákat kimérák jelenlétére teszteltük az UCHIME 52 alkalmazásával, és az OTU-kat csoportosítottuk a szekvencia hasonlóságának 97% -os küszöbén. A téves OTU-k elemzésének elkerülése érdekében legalább egy mintában csak azokat tároltuk, amelyek relatív gyakorisága meghaladja az összes szekvencia 0,5% -át. A SILVA (SILVA Incremental Aligner 1.2.11 verzió) 53 és az RDP osztályozót (15. mondat; 80% -os bizonyosság) 54 alkalmazták az OTU-t reprezentáló szekvenciák rendszertani besorolásához. A csoportok között különböző gyakorisággal rendelkező specifikus OTU-kat az EzTaxonnal azonosították. A filogenetikai összefüggéseket az általánosított UniFrac 55 módszer alkalmazásával vizsgáltuk. Shannon effektív számlálást alkalmaztunk a mintán belüli diverzitás (alfa diverzitás) becsléséhez, Jost és mtsai. 56 .
Statisztikai analízis
Az adatokat R programozási környezetben elemeztük. Az antropometriai és metabolikus adatokat átlag ± szórásként adjuk meg. P-értékeket használtunk. A VLCD hatását az OTU-kra és a taxonómiai összeírásokra a Friedman Rank teszt segítségével teszteltük, hogy elemezzük a nem paraméteres randomizált blokktervet. A hiányzó értékeket Skillings Mack teszttel kezeltük. A páros összehasonlításhoz a Wilcoxon Signed Rank Sum Tesztet illesztett párokhoz alkalmaztuk. A beállításhoz több teszt után a Benjamini-Hochberg-módszert alkalmazták. A béta változatosság elemzéséhez általánosított UniFrac távolságokat számoltunk ki a GUniFrac 55 csomaggal.
hálaadás
Köszönjük Dr. Claudia Eichhorn a tűszívás elvégzéséért, Julius Honecker a zsírsejtméret mérésének kiváló támogatásáért, Dr. Karin Norman a bélpermeabilitás mérésében nyújtott támogatásáért, Manuela Hubersberger a kiváló technikai támogatásért és Caroline Ziegler Angela Sachsenhauserként a ZIEL Core Facility Microbiome/NGS-től a nagy áteresztőképességű szekvenálás mintájának előkészítésében nyújtott kiváló támogatásáért. Ezt a tanulmányt a BMBF (Szövetségi Oktatási és Kutatási Minisztérium, 0315674. sz. Támogatás) finanszírozta. A receptes étrendet a Nutrition Santé SAS (Revel, Franciaország) nyújtotta.
Kiegészítő elektronikus anyagok
Kiegészítő fájl
Megjegyzések
Megjegyzés benyújtásával elfogadja a felhasználási feltételeket és a közösségi irányelveket. Ha valami visszaélést tapasztal, vagy nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.