A ligandumkötés vizsgálatának módszerei
A ligandumkötések vizsgálatának módszerei Egyensúlyi dialízis Modul enzim kinetikája: Fej: Prof. Hans Bisswanger Felügyelet: Elena Kracker Tesztprotokoll: Paula Quecke Stefan Mogk 1/15 oldal
Borítókép: Dialízis blokk Az ábra sematikus, és nem a ténylegesen piacon lévő termékekre vonatkozik. A bemutatott blokk két cellára oszlik, amelyeket egy membrán egy belső és külső kamrába oszt. 1 Tárgymutató 1.1 Tartalomjegyzék 1 Tárgymutató. 2 1.1 Tartalomjegyzék. 2 1.2 Ábrák felsorolása. 2 2 Bevezetés. 3 3 Anyag és módszerek. 3 3.1 Vegyszerek és műszerek. 3 3.2 Indol teszt. 4 3.3 Egyensúlyi dialízis. 5 4 Kísérleti rész. 7 4.1 Az indol teszt kalibrálása. 7 4.2 A dialízis idő meghatározása. 8 4.3 Egyensúlyi dialízis elvégzése. 10 5 Összegzés és vita. 14 6 Irodalom. 15 1.2 Az ábrák felsorolása 1. ábra: Indol festés Ehrlich reagensével. 4 2. ábra: Hogyan működik az egyensúlyi dialízis? 5 3. ábra: Lehetséges értékelési módszerek. 6 4. ábra: Az indol teszt kalibrálása. 8 5. ábra: A dialízis idő meghatározása. 9 6. ábra: Indol eloszlás (kihalás) dialízis után. 12 7. ábra: Indol eloszlás (koncentráció) dialízis után. 12 8. ábra: Értékelés közvetlen alkalmazás útján. 13 9. ábra: Értékelés kettős kölcsönös ábrázolással. 13 10. ábra: Scatchard kiértékelés. 14 2. oldal/15
Átvitel T = I/I 0 [] (1) Abszorpció A = 1-T [] (2) Kihalás E = ε * c * d [] (3) E = log 1/T (4) ε: c extinkciós koefficiens: D koncentráció: Rétegvastagság 3.3 Egyensúlyi dialízis A dialízis sejteket meghatározott és pórusméretű féligáteresztő membrán osztja fel egy külső és egy belső kamrára: 2. ábra: Hogyan működik az egyensúlyi dialízis ligandum szerint radioaktívan jelölt) különböző koncentrációban. A membrán csak az alacsony molekulatömegű ligandumnak (kulcsszó kizárási határérték) áteresztő, a koncentrációs gradienst diffúzióval kompenzálják. A makromolekula által megkötött ligandumot kivonják az egyensúlyból, és beáramló ligandumok helyettesítik, amíg a ligandum szabad kamrája mindkét kamrában meg nem egyezik. Az egyensúlyban a következők érvényesek: [ligand, kívül] = [ligand, belül, szabad] (5) [ligand, belül, összesen] = [belül, szabad] + [belül, kötött] (6) 5 az 6-ban [Belül, bekötve] = [belül, összesen] [ligand, kívül] (7) 5. oldal, 15
4. kísérleti rész 4.1. Az indol-teszt kalibrálása Annak érdekében, hogy a mért abszorbancából kiszámíthassuk az indol-koncentrációt, elkészítettünk egy ismert indolmennyiségű hígítási sorozatot, és az indol-tesztet a leírás szerint hajtottuk végre. A disszociációs állandó körüli koncentrációkat szándékosan választottuk a hígítási sorozathoz. 1. táblázat: Az indol teszt kalibrálása Indol 1: 100 KPP (1000 µm) (0,1 M) V [µl] V [µl] c [µm] E [] *) (572 nm) 0 250 0 0,000 5 245 20 0,041 10 240 40 0,082 15 235 60 0,110 20 230 80 0,159 (Kd = 100 µm) 25 225 100 0,207 50 200 200 0,363 Koncentráció a 75 175 300 0,507 1/10 Kd tartományban