A megnövekedett alkohol- és cigarettafogyasztás rövid távú hatásainak vizsgálata a

alanyok

absztrakt

bevezetés

A meddőség a teherbe esni próbáló párok körülbelül 15% -át érinti, és az esetek felében az ok a férfi reproduktív problémákhoz kapcsolódik 1. A férfi meddőségi esetek nagy százaléka idiopátiás (

Portugáliában megnőtt az alkoholfogyasztás a 15 évnél idősebbek körében (átlagosan 12,9 liter/fő/év) 14, míg a 15 év feletti portugálok 14 32,4% -a dohányzott. A portugál akadémiai ünnepségek során erős hagyománya van az akut alkohol-, cigaretta- és kábítószer-fogyasztásnak. Ez kivételes feltételeket biztosít a probléma tanulmányozásához, mivel nagyszámú fiatal férfi önként kitett magának magas szintű káros tényezőknek egy jól meghatározott és korlátozott ideig, akik viszonylag egészséges életmódot folytattak az expozíció előtt és után.

A tanulmány célja az akut életmódbeli változások, különösen az alkohol- és cigarettafogyasztás korai és késői rövid távú hatásainak vizsgálata volt az emberi spermiumok és az oxidatív egyensúly alapvető paramétereire. Tekintettel a magsejt-plazma fontosságára a spermiumok érése, táplálkozása és védelme szempontjából, az epididymis és a parietalis mirigyek működését is értékelték.

Mód

Tanulmányterv és résztvevők

Számos életmódbeli tényező hatását vizsgálták a sperma minőségére egészséges, reproduktív korú fiatal önkéntes férfi mintákban három pontosan meghatározott pillanatban: előtte (1. időpont - TP1), egy héten (2. időpont - TP2) és három hónapon (3. időpont - TP3). a portugál akadémiai ünnepségek (7 napos esemény) után, ahol hagyomány az alkohol, a cigaretta és a kábítószer-fogyasztás (1. ábra). Csak azokat az önkénteseket vettük figyelembe, akik mindhárom TP-ben mintát szolgáltattak.

Az akadémiai ünnepségek során tapasztalt mérhetetlen zavarók olyan tényezőket tartalmaznak, mint az étrend és a cirkadián ritmus megváltozása. TP, időbeli pontok.

A tanulmányt az Aveiro Egyetem campusán hirdették meg, és csak az egyetem hallgatóit vették fel önkéntesként. A reklám egyértelműen megfogalmazta a tanulmány hipotézisét és fő célkitűzéseit, pénzügyi ellentételezést nem alkalmaztak. Valamennyi résztvevő világos írásbeli utasításokat kapott a mintavétel módjáról, és minden alkalommal, amikor mintát vett, válaszolt egy támogatott kitöltési kérdőívre. A kérdőívek kérdéseket tartalmaztak az absztinencia időtartamáról, korábbi/közelmúltbeli betegségekről, kábítószer- és alkoholfogyasztásról, cigaretta- és kábítószer-fogyasztásról (például kannabisz és kokain). Az alkoholfogyasztási paramétert a becsült teljes alkoholmennyiségként határozták meg (grammban). Az SP1 és SP3 esetében ez a paraméter figyelembe vette az akadémiai ünnepségek előtti hónap heti alkoholfogyasztását. A TP2 az alkoholfogyasztást tükrözte az akadémiai fesztiválhéten. A cigarettafogyasztási paramétert a becsült teljes nikotinmennyiségként határoztuk meg (milligrammban). Az SP1 és SP3 esetében ez a paraméter figyelembe vette a heti nikotinfogyasztást az akadémiai ünnepségek előtti hónapban. A TP2 tükrözte a nikotinfogyasztást az akadémiai fesztivál hetében. Minden adatot névtelenítettek.

Etikai elismerés

Ezt a tanulmányt az Infante D. Pedro Kórház EPE etikai és belső felülvizsgálati bizottsága, Aveiro, Portugália hagyta jóvá (folyamatszám: 36/AO), és a Helsinki Nyilatkozat etikai normáinak megfelelően készült. Valamennyi résztvevő egyértelmű írásbeli utasításokat kapott a vizsgálat megtervezéséről, és beleegyező nyilatkozatot írt alá, amely lehetővé tette a minták tudományos célokra történő felhasználását.

Sperma mintavétel, alapvető spermaelemzés és spermiumkészítés

A spermamintákat maszturbálással, steril tartályban nyertük, és 30 percen belül szállítottuk az alap spermaelemzéshez. Valamennyi mintát tapasztalt technikusok elemezték az Egészségügyi Világszervezet 15 kritériumai szerint. Röviden, miután a spermaminták körülbelül 30 percig 37 ° C-on teljesen cseppfolyósodtak, makroszkópos vizsgálatot végeztek. A mikroszkópos vizsgálat magában foglalta a spermiumok mozgékonyságának, koncentrációjának és morfológiájának elemzését. Az összes mikroszkópos elemzést Zeiss Primo Star mikroszkóppal (Carl Zeiss AG, Németország) végeztük. A spermamintákat háromszor mostuk PBS-ben. Az első mosás után nyertük a magplazmát, és további vizsgálatokhoz használtuk fel. A spermakivonatokat 1% SDS-ben reszuszpendáltuk. A fehérjekoncentrációt bicinchonsav-vizsgálattal (Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, USA) mértük, és a végső abszorbanciát 562 nm-en mértük egy mikrolemez-olvasón (Infinite® 200 PRO sorozat, Tecan Trading AG, Svájc).

A szuperoxid-diszmutáz 1 (SOD1) és a glutation-peroxidáz 4 (GPx4) antioxidáns enzimek expressziójának Western blot-analízise

A spermiumok kivonatait ultrahanggal kezeltük, felforraljuk, és azonos mennyiségű fehérjét (50 ug) 10% SDS-PAGE gélbe töltünk és nitrocellulóz membránra visszük. Az immundetektálást egér anti-SOD1, 1: 1000 (MABC864, Merck Milipore, Darmstadt, Németország) és nyúl anti-GPx4 (ABC269, Merck Milipore, Darmstadt, Németország) alkalmazásával végeztük, majd inkubáltuk a megfelelő infravörös -Második antitestek (1: 5000, LI-COR Biosciences UK Ltd., Cambridge, Egyesült Királyság). Béta-tubulint (Merck Milipore, Darmstadt, Németország) használtunk terhelés kontrollként. A membránt egy Odyssey infravörös képalkotó rendszerrel (LI-COR Biosciences, Cambridge, Egyesült Királyság) pásztáztuk.

A karbonilcsoport (CG) meghatározása slot blot alkalmazásával

A 30 µg fehérjét tartalmazó spermium-kivonatokat 20 mM 2,4-dinitrofenil-hidrazinnal 10% trifluor-ecetsavban oldva derivatizáltuk, és 1,5 térfogatrész 2 M Tris-oldattal semlegesítettük 18% -os merkaptoetanollal. A résblot elvégzéséhez a mintát 0,002 μg/μl-re hígítottuk, és egy nitrocellulóz membránba helyeztük a résblot készülékben (BioRad Portugal, Sintra, Portugália). A membránt inkubáltuk nyúl anti-DNP-vel, 1: 5000 (MAB2223, Merck KGaA, Darmstadt, Németország), majd egy nyúlellenes infravörös másodlagos antitesttel (1: 5000, LI-COR Biosciences UK Ltd., Cambridge, Egyesült Királyság). A detektálást az Odyssey infravörös képalkotó rendszerben (LI-COR Biosciences, Cambridge, Egyesült Királyság) végezték.

A 3-nitrotirozin (3-NT) meghatározása spermában slot blot alkalmazásával

A spermiumok kivonatai 1xTBS-ben voltak, a végső koncentráció 1 | g/µ hígítottam. A mintákat slot blot-ban (BioRad Portugal, Sintra, Portugália) vittük fel nitrocellulóz membránban. Ezt követően a membránt bevontuk nyúl anti-nitrotirozinnal, 1: 1000 (DAM1514077, Merck KGaA, Darmstadt, Németország), majd egy nyúlellenes infravörös másodlagos antitesttel (1: 5000, LI-COR Biosciences UK Ltd, Cambridge, UK) inkubálták. A detektálást az Odüsszeia infravörös képalkotó rendszerben (LI-COR Biosciences UK Ltd., Cambridge, Egyesült Királyság) végeztük.

Általános antioxidáns státus (TAS)

Az antioxidánsok koncentrációját a spermium sejtekben a teljes antioxidáns státus (TAS) assay (NX2332, Randox Laboratories, Crumlin, Észak-Írország) alkalmazásával mértük. A gyártó által biztosított protokollt úgy módosították, hogy mikrolemez használható legyen (a reagensek és a minta mennyisége csökkent).

Az epididymális és kiegészítő nemi mirigy markerek biokémiai elemzése

Az epididymis működésének biokémiai markereit (semleges α-glükozidáz, NAG), a prosztata funkcióját (citromsav) és a szemed vezikulum funkcióját (fruktóz) értékeltük a szeminális plazmában. A teljes NAG aktivitást egy kereskedelemben kapható EpiScreen Plus α-glükozidáz vizsgálattal (FertiPro, Beernem, Belgium) mértük a gyártó utasításainak megfelelően. A fruktóz mennyiségének meghatározásához az őssejt-plazmában a fruktóz-tesztet (FertiPro, Beernem, Belgium) alkalmaztuk a gyártó utasításainak megfelelően. A citromsavtartalmat a magvas plazmában citromsav-teszt alkalmazásával (FertiPro, Beernem, Belgium) mértük a gyártó utasításainak megfelelően.

Statisztikai analízis

Eredmények

Összesen 36 egészséges kaukázusi férfi diák vett részt ebben a vizsgálatban, átlagéletkoruk 22 ± 3 év volt. Korábbi terhességekről, orvosi kísérő betegségekről, gyógyszeres kezelésről vagy drogfogyasztásról nem számoltak be az adatkészlet résztvevői. Az eredmények leíró elemzését az 1. táblázat mutatja be. Csak a statisztikailag szignifikáns eredményeket írjuk le az alábbiakban (2. ábra, 2. táblázat). A vizsgálati idők (TP) közötti összes páros különbséget az S1 kiegészítő táblázat ismerteti.

Az alkohol dobozdiagramja ( A. ) és a nikotinfogyasztás ( B. ), az alapvető sperma paraméter ( C. - K ), az oxidatív stressz markere ( L. ) és az epididymus működését ( M. ) és a kiegészítő nemi mirigyek ( és O ) különböző időpontokban (TP). A párosított mintákkal végzett vizsgálatok P-értékeit a 2. táblázat foglalja össze.

Az akadémiai ünnepségek hatása a sperma alapvető paramétereire és a spermium oxidatív stressz markereire

A napi alkoholfogyasztás több mint nyolcszorosára nőtt a TP1 és a TP2 között. A TP3-ban az alkoholfogyasztás szintje az alapértékekre (TP1) esett (2A. Ábra; 2. táblázat). A TP2-ben a nikotinfogyasztás szignifikánsan nőtt a TP1-hez képest (kétszeres) (2B; 2. táblázat).

Megfigyeltük az alapvető magparaméterek különbségeit (2C-K. Ábra; 2. táblázat). A spermatérfogat szignifikáns csökkenést mutatott a TP-khez képest (18% TP1-től TP2-ig; 19% TP2-től TP3-ig; 33% -ig TP1-től TP3-ig) (2C. Ábra, 2. táblázat). A spermiumkoncentráció és az ejakulátum spermájának teljes száma szignifikánsan csökkent TP1-ről TP3-ra (20%, illetve 52%) (2D és E; 2. táblázat). A progresszív mozgékonyság százalékos aránya TP1-ről TP2-re csökkent (15%) (2F. Ábra; 2. táblázat). A nem progresszív mozgékony spermiumok százaléka a TP-k felett nőtt (40% TP1-től TP2-ig; 50% TP1-től TP3-ig) (2G ábra; 2. táblázat). Az immotilis spermiumok százaléka szignifikánsan csökkent TP1-ről TP2-re (14%) (2H ábra; 2. táblázat). A spermiumok morfológiáját tekintve a normál spermiumok százaléka szignifikánsan magasabb volt a TP1-ben a TP2-hez és a TP3-hoz képest (2I; 2. táblázat). Különösen a fej és a középső rész hibái voltak magasabbak a TP2-ben, mint a TP1 és a TP3-nál (2J és K ábra; 2. táblázat).

A spermiumokban a 3-nitrotirozin (3NT) szintje volt az egyetlen oxidatív stressz marker, amely szignifikáns változást mutatott (2L. Ábra; 2. táblázat). A TP2-ben a nitrózistól szenvedő tirozin-maradékok szintje 1,4-szer magasabb volt, mint a TP3-ban.

Az akadémiai ünnepségek hatása az epididymis és a kiegészítő nemi mirigyek működésére

Jelentős csökkenés mutatkozott a semleges α-glükozidáz (NAG) aktivitásában az ejakulátumban TP1-TP3-ra (46%) és TP2-ről TP3-ra (35%) (2M ábra; 2. táblázat). Az ejakulátumban lévő teljes fruktózmennyiség tekintetében szintén szignifikáns csökkenés volt megfigyelhető a TP1-ről TP3-ra (28%) és a TP2-ről TP3-ra (23%) (2N; 2. táblázat). Az ejakulátumban a citromsav teljes mennyisége szignifikánsan alacsonyabb volt a TP3-ban a TP1-hez képest (36%) (2O; 2. táblázat).

vita

Különböző életmódbeli tényezőket kapcsolnak össze a férfiak reprodukciós problémáival 5, 6, 16, 17. A mérgező anyagok spermára gyakorolt hatásait vizsgáló tanulmányok azonban ellentmondásosak és gyakran elfogultak 5, 18, 19. E problémák leküzdése érdekében tanulmányi modellként alkalmazták az akadémiai ünnepeket, mivel 7 napon belül egyszerre számos életmód-változás történt (1. ábra). Ez a modell kivételes feltételeket biztosít az akut életmódbeli változások fiatal és egészséges népességre gyakorolt hatásainak tanulmányozásához.

Vizsgálatunk azt mutatja, hogy az akut alkohol- és cigarettafogyasztás, az önkéntesek más bántalmazó magatartásával együtt, az akadémiai hét során, jelentős korai (SP2) és késői (SP3) rövid távú hatást gyakorolt a sperma minőségére (2. és 3. ábra). . A várakozásoknak megfelelően az alkohol és a cigarettafogyasztás az egyetemi ünnepségek alatt növekedett az egyetemi ünnepek előtt egy héttel és három hónappal azután megfigyelt szintekhez képest (2. ábra). Az életmódnak ez a hirtelen változása korai és késői káros hatásokkal járt a sperma minőségében. A spermatérfogat, a spermiumkoncentráció, a spermiumok összlétszáma, a progresszív mozgékonyság és a normál morfológia csökkent a NAG aktivitással, valamint az ejakulátumban lévő fruktóz és citromsav mennyiségével együtt. Ezenkívül a nem előrenyomuló és mozgásképtelen spermiumok százalékos aránya növekedett a fehérje nitrációs értékekkel együtt (2. és 3. ábra).

Beszámoltak arról, hogy a krónikus alkohol- és cigarettafogyasztás a kiegészítő mirigyek meghibásodásához vezethet 20, 21. Eredményeink azt sugallják, hogy az életmód akut változásai rövid távon negatív hatást gyakorolnak az epididymis és a kiegészítő nemi mirigyek működésére, ami tükröződik a sperma mennyiségének csökkenésében a TP-kben is.

Ez a tanulmány azt is mutatja, hogy az életmód heveny változásai, elsősorban az alkohol és a cigaretta fogyasztásának növekedése miatt, jelentős hatással vannak a sperma morfológiájára. Egy héttel (TP2) és 3 hónappal (TP3) az életmód akut változásai után megnövekedett fej- és középső defektusok számát, valamint a morfológiailag normális spermiumok csökkenő arányát figyelték meg, ami hatással van az epididimisz morfológiailag érett spermiumára és a herék spermaképződésére. bezáródhat (2. ábra). Egy tanulmány kimutatta, hogy nagyon kevés alkoholista férfi normozoospermium, ami felerősíti az alkohol spermamorfológiára gyakorolt káros hatásait 5. A spermatozoák koncentrációja és a morfológiailag normális spermatozoák aránya 3 hónappal az akadémiai ünnepségek után csökkent, ami arra utal, hogy a spermatogenezis folyamata károsodott.

A vizsgálat informatív értékét korlátozza a viszonylag kis teljes mintaméret és az alkohol-, cigaretta- és kábítószer-expozícióra vonatkozó visszamenőleges információk felhasználása miatt a téves osztályozás kockázata. Figyelembe kell venni a szelekciós torzítást is, mivel minden önkéntes kaukázusi volt. Továbbá nem zárhatjuk ki, hogy eredményeink nem mérhető zavaró tényezőknek köszönhetők, beleértve az étrendet, a cirkadián ritmus változását, a testmozgást és a stresszt.

Az akadémiai ünnepségeken a lakosság szokásos magatartása miatt nagyon nehéz volt olyan alanyokat toborozni, akik nem változtattak életmódjukon a TP2-ben. Valójában a mintánkban csak 2 ember felel meg ennek a kritériumnak. Megfigyelhető azonban, hogy az eredmények általános tendenciája azt sugallja, hogy az életmódbeli változások hátrányosan befolyásolják a sperma minőségét. Ha az eredmények a spermanalízis természetes különbségei miatt következnek be, akkor véletlenszerű változási minta várható.

A minimális minta nagyságát a populációs információk hiánya miatt nem számolták ki. Az adathalmaz méretét azonban megfelelőnek ítélték, mert a központi határ tétel lehetővé tette a változók eloszlásának normál eloszlásának megközelítését.

Ez a tanulmány hozzájárult az akut életmódbeli változások okozta sperma minőség romlásának hátterében álló patofiziológia jobb megértéséhez. Ez arra utal, hogy a különösen magas alkohol- és cigarettafogyasztás az egészséges fiatal férfiak sperma minőségének csökkenésével jár, és káros hatással van az összes spermaparaméterre. A spermiumot érintő oxidatív stressz növekedése, valamint a mellékhártya és a kiegészítő nemi mirigyek károsodott működése. Az egészséges férfiaknak ezért azt lehet tanácsolni, hogy az életmód alkalmanként bekövetkező akut változásai rövid távon károsítják termékenységüket. További vizsgálatokra van szükség annak megértéséhez, hogy a sperma minősége helyreáll-e, vagy az életmód heveny változásainak hosszú távú hatása van-e.

további információ

Hogyan idézhetem ezt a cikket: Vieira Silva, J. és mtsai. A megnövekedett alkohol- és cigarettafogyasztás rövid távú hatásainak vizsgálata az egészséges fiatal férfiak sperma minőségére. Sci. ismétlés. 7., 45457; doi: 10, 1038/srep45457 (2017).

A szerkesztő megjegyzése: A Springer Nature semleges marad a közzétett térképeken és az intézményi kapcsolatokban szereplő joghatósági igények tekintetében.

További információ

PDF fájlok

Kiegészítő S1 táblázat

Megjegyzések

Megjegyzés benyújtásával elfogadja a felhasználási feltételeket és a közösségi irányelveket. Ha valami visszaélést tapasztal, vagy nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.