A metotrexát hatása a homocisztein anyagcserére A leukémia és
1 A metotrexát hatása a homocisztein anyagcseréjére: leukémiás és limfómás betegek vizsgálata Értekezés a Rheinische-Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn matematikai és természettudományi karának doktori fokozatának megszerzéséért (Dr. rer.nat.), ACHIM BECKER, Trier Bonn, 2004
2 Készült a Rheinische-Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn matematikai és természettudományi karának engedélyével. Ezt a disszertációt elektronikusan teszik közzé az ULB Bonn egyetemi publikációs szerverén. 1. Előadó: Prof. Dr. U. Jaehde 2. előadó: Prof. Dr. G. Benda érettségi napja:
4 Különösen szeretnék köszönetet mondani Jutta Schneider barátnőmnek a türelemért és a készséges segítségért, különösen a munka utolsó szakaszában. Végül szeretnék köszönetet mondani anyámnak és testvéreimnek, akik mindig támogattak és mindig megbízható támogatást nyújtottak nekem nehéz idõszakokban is.
5 A Családom kétsége nem kényelmes, de a bizonyosság abszurd. Voltaire
6 Tartalom 1 Bevezetés Homocisztein Homocisztein anyagcsere A hiperhomociszteinémia okai A hiperhomociszteinémia klinikai tünetei és terápiás ajánlások Patomechanizmusok Metotrexát Kémiai szerkezet Farmakokinetika Hatásmechanizmus Klinikai alkalmazások MTX probléma neurotoxicitása Probléma és objektív Anyag és módszerek Anyagok Vegyszerek és reagensek Használt oldatok és pufferek Fogyóeszközök. 35
7 Tartalom-jegyzék A kapilláris elektroforézis alapjai Szétválasztó rendszer kifejlesztése kéntartalmú gerjesztő aminosavak meghatározására (SEAA) Módszer kidolgozása Módszer optimalizálás az SEAA meghatározásához folyadékban A CE módszer validálása A folyadékminták mérése HPLC elemzés HPLC rendszer és kromatográfiai körülmények Az aminotiolok redukciója és oszlop előtti derivatizálása Módszer fejlesztés -optimalizálási módszer validálása a CSF minták fluoreszcencia polarizációs immunvizsgálatának mérési elve a fluoreszcencia polarizáció immunanalízise az IMP rendszer mérési specifikációinak végrehajtása az FPIA módszer validálása az FPIA módszer részleges validálásával a homocisztein meghatározására plazma klinikai vizsgálatokban akut lymphocytás leukémiában szenvedő gyermek betegeknél. 68
8 Tartalom-jegyzék A központi idegrendszer primer limfómájában szenvedő felnőtt betegek Egészséges felnőttek (kontrollcsoport) MTX-túladagolásban szenvedő beteg esettanulmánya Farmakokinetikai számítások Tisztaság AUC Statisztikai adatok elemzése Leíró statisztikák Statisztikai tesztek a differenciális hipotézisek teszteléséhez Korrelációs elemzés Regresszió-analízis Eredmények CE módszer a ként tartalmazó gerjesztő aminosavak meghatározására A ként tartalmazó gerjesztő aminosavak CSF-elválasztása A derivatizálás optimalizálása Az UV- és LIF-detektálás érzékenységének összehasonlítása Módszer-optimalizálás CSF-analízishez Validációs HPLC-módszer a cisztein, homocisztein és glutation meghatározására CSF-ben. 111.
9 Tartalom-jegyzék Módszer fejlesztése/optimalizálása A HPLC módszer validálása Az FPIA részleges validálásának eredményei A nagy dózisú MTX befolyásolásának homocisztein metabolizmusára vonatkozó részeredményei Akut limfoblasztos leukémiában szenvedő gyermekgyógyászati betegek vizsgálata (XV. Vizsgálat) PZNSL betegek vizsgálata MTX túladagolásban szenvedő betegek esete Megbeszélés CE módszer a ként tartalmazó gerjesztő aminosavak meghatározására CSF HPLC módszerben a homocisztein, a cisztein és a glutation meghatározására a CSF-ben A nagy dózisú MTX kemoterápia hatása a homocisztein anyagcseréjére Tanulmányok ALL-es gyermekgyógyászati betegeknél PZNSL-ben szenvedő betegek esettanulmánya MTX túladagolásban szenvedő beteg Homocisztein, az MTX által kiváltott neurotoxicitás biomarkere? Összefoglaló irodalom melléklet. 222
10 Rövidítések listája ABDF AG AICAR AICAR-TF AK AL ALL ASP ATP BHMT C1 (8), (15) C1h23 (42) C15h23 (42) CA CBQCA CBS CGL CFSE cp ss CNS CSA CV CYS DAMPA DHB DHF DHFR DHP DHPR 4- ( Aminoszulfonil) -7-fluor-benzofurazan antigén aminoimidazol-karboxamid-ribonukleotid aminoimidazol-karboxamid-ribonukleotid transzformiláz antitest munkaoldat akut limfatikus leukémia L-aszparaginsav (aszpartát) adenozin-trifoszfát-betain homocisztein 1. vagy 8. vagy 15. vagy 1. nap konszolidáció 1. konszolidációs napja, 23 (42) órával a nagy dózisú MTX infúzió megkezdése után 15. konszolidáció 15. napja, 23 (42) órával a nagy dózisú MTX infúzió megkezdése után Cisztein-szulfonsav 4- (2-formil-3-kinolin-karbonil) -benzoesav-cisztationin-ß-szintáz cisztationin-γ-liáz-5-karboxifluoreszcein-szukcinimidil-észter egyensúlyi koncentrációja a plazma központi idegrendszerben (központi idegrendszer) cisztein-szulfinsav variációs koefficiens (variációs koefficiens) cisztein 2,4-diamino-N 10 -metil-p teroesav-dihidrobiopterin-dihidrofolsav (dihidrofolát) -dihidrofolát-reduktáz dihidropteridin-dihidropteridin-reduktáz
11 DMF DTT E ECD EDTA EOF FD FDA FGAR FICAR FITC FPGS FPGH FPIA FQCA FR GAR GAR-TF GLU GSH GTP HCY HCSA HCA HDMTX HR ICV ICVMTX IMP IT ITMTX iv Food & Drug Administration Formylglycinamidribonukleotid 5-formamido-imidazol-4-carboxamidribonukleotid fluoreszcein folsav-folát Polyglutamatsynthetase Polyglutamathydrolase fluoreszcens polarizációs immunoassay 3- (2-furoil) -kinolin-2-karbaldehid-folát-receptor Glycinamidribonukleotid Glycinamidribonukleotid transzferáz glutaminsav (glutamát) glutation guanozin-trifoszfát a homocisztein Homocysteinsulfinsäure Homocisztein-szulfonsav Nagy dózisú terápia metotrexáttal (intravénásan adva) Nagy kockázatú intracerebroventrikuláris Intracerebroventrikulárisan alkalmazott metotrexát Intramuszkuláris Inozin-monofoszfát Intratekálisan Intratekálisan beadott metotrexát Intravénásan
12 K KPF LDL LIF (D) LLOQ LOD LR MAT ME MP MEKC MeOH mfbp MS MTHFR MTX MTX Kontrollcsoport Korrigált csúcsterület Kis sűrűségű lipoproteinek Lézer-indukált fluoreszcencia (detektálás) A kvantifikáció alsó határa (a kvantifikáció alsó határa) A detektálás határa (detektálási határ) Alacsony -Risk metionin-adenozil-transzferáz merkaptoetanol merkaptopropanol Micelláris elektrokinetikus kromatográfia metanol membránhoz kapcsolódó folátkötő fehérje metionin-szintáz N 5, N 10 -metilén-tetrahidrofolát-reduktáz-metotrexát-metotrexát-poliglutamát (e) µ N 5 -FTHF N 10 -FTHF NHL N 5, N 10 -MTHF N 5 -MTHF NMDA PRPP PO PZNSL QC-Probe r N-acetil-cisztein N 5 -formil-tetrahidrofolát N 10 -formil-tetrahidrofolát Non-Hodgkin-limfóma N 5, N 10 - Metilén-tetrahidrofolát N 5-metil-tetrahidrofolát N-metil-D-aszpartát α-5-foszforibozil-1-pirofoszfát per os (orális) A központi Ne primer lymphoma rvensystems minőségellenőrzési minta korrelációs együttható
13 RE RFC RI ROS RSD S SD SAH SAHH SAM SBDF SDS SEAA SHR SL SR ss t ½ TBP THB THF TIT ULOQ v VK Relatív hiba (relatív hiba) Csökkent foláthordozó remisszió/indukció Reaktív oxigén fajok Relatív szórás (variációs koefficiens) Standard szórás (Szórás) S-adenozil-homocisztein S-adenozil-homocisztein-hidroláz S-adenozil-metionin-4- (szulfo) -7-fluor-benzofurazán-nátrium-dodecil-szulfát Kéntartalmú gerjesztő aminosavak (kéntartalmú, gerjesztő, állandó aminosavak) standard/magas kockázatú törzsoldat standard állapot-kockázat Felezési idő Tributil-foszfin Tetrahidrobiopterin Tetrahidrofolsav (tetrahidrofolát) Intrathekális hármas terápia A kvantifikáció felső határa (a kvantifikálás felső határa) Migrációs sebesség Variációs együttható x átlagérték x
Medián Z Transzformált korrelációs együttható CNS Központi idegrendszer
19 Page 6 Bevezetés A friss gyümölcs és zöldség hiánya, a foláthiány a leggyakoribb vitaminhiány Európában. Az átlagos napi folátfogyasztás étellel (
25 Page 12 Bevezetés A homocisztein által közvetített neurotoxikus reakciók jelentősen csökkenthetők a 67,71,72 NMDA receptor antagonisták alkalmazásával. Cl - csatornás Ca 2+ csatornás kainát NMDA AMPA mglu Na + Na + Na + PLC Cl - Ca 2+ IP 3/DAG proteázok (Kalpaine I/II), foszfolipázok (PLA 2, PLC), endonukleázok, protein kinázok (CaMPK II, PKC), NO szintáz lipidperoxidáció, citoszkeleton, DNS és mitokondrium károsodása Osmotikus lízis, apoptózis 1-3. Ábra: Az excitotoxicitás mechanizmusa. Rövidítések: Kainate: Kainate receptor; NMDA: N-metil-D-aszpartát (receptor); AMPA: L-a-amino-3-hidroxi-5-metil-izoxazol-4-propionsav (receptor); mglu: metabotrop glutamát receptor; PLC: foszfolipáz C; IP 3: inozitol-trifoszfát; DAG: Diacil-glicerin Az is megvitatásra kerül, hogy az agyi erekben a homocisztein által kiváltott érelmeszesedés változások iszkémiához és hipoxiához vezethetnek, és ezáltal károsodhatnak az idegsejtek 77. Feltételezhető, hogy a cisztein magasabb koncentrációban neurotoxikus hatásokat okoz. Ez az additív toxicitás különösen fontos lehet akkor jönnek létre, amikor a vér-agy vagy a vérlúg gátat károsítja a daganatokkal való behatolás vagy a sugárzás, és nagy mennyiségű cisztein juthat a vérből a központi idegrendszerbe.
29 Page 16 Bevezetés olyan, mint az MTX, és képesek közvetlenül gátolni a purin bioszintézis enzimjeit, nagy jelentőséggel bírnak a citotoxicitás (ok) szempontjából. HNN NH 2 NN HOOC HNN NH 2 CH 3 O COOH MTX karboxipeptidáz-aldehid-oxidáz HO HNNNN NH 2 CH 3 N NH 2 folsav-poliglutamát-szintetáz HOOC HN HO HNNNN NH 2 CH 3 N NH 2 OO 2,4-diamino-N 10 -metil-peronsav ( DAMPA) HNN COOH NH 2 7-hidroxi-metotrexát (7-OH-MTX) NN HOOC HNN NH 2 CH 3 O CO (GLU) n Metotrexát-poliglutamát (MTX-PG) 1-5. Ábra: Az MTX metabolizmusa.
32 Bevezetés 19. oldal Glicinamid-ribonukleotid (GAR) vagy az 5-amino-imidazol-4-karboxamid-ribonukleotid állni. 2- O3 PO CH 2 O PRPP OH OOOPOPO - OH O - O - OH 2 NH 2 NN AICAR N Ribóz P 2- O3 PO CH 2 OH O HN OH C CH 2 O GAR NH 2 AICAR-TF X MTX-PG BE 10 -FTHF THF GAR-TF MTX-PG XN 10 -FTHF THF OH 2 N CH HN N FICAR N Ribóz PH 2 CCOHN CH O NH Ribóz P FGAR OH 2 O HN NN IMP N Ribóz P 1-7. Ábra: MTX-PG purinbázisok de novo szintézisével (kiválasztott lépések). Rövidítések: PRPP: α-5-foszforibozil-1-pirofoszfát, GAR: glicinamid-ribonukleotid, GAR-TF: GAR-transzformiláz, FGAR: formilglicin-amid-ribonukleotid, N10-FTHF: N10-formil-tetrahidrofolát, THF: tetrahidrofol 4-karboxamid-ribonukleotid, AICAR-TF: AICAR-transzformiláz, FICAR: 5-formamido-imidazol-4-karboxamid-ribonukleotid, IMP: inozin-monofoszfát.