A monocita kemotaktikus aktivitásának mennyiségi meghatározása in vivo és a vér monocita jellemzése

Összegzés

Itt bemutatunk egy protokollt a vér monociták kemotaktikus aktivitásának számszerűsítésére egérmodellekben, hogy értékeljük a táplálkozási, farmakológiai és genetikai beavatkozásoknak a vér monocitákra gyakorolt hatását, valamint a denmoncita eredetű makrofágokat egér modellekben monocita-kemoattraktáns fehérje-1 (MCP-1) alkalmazásával. -töltött bazális membrán-szellőztetett géldugók.

Absztrakt

Bevezetés

Jegyzőkönyv

A jelen jegyzőkönyvben leírt összes módszert jóváhagyta a Wake Forest Orvostudományi Intézmény Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága.

1. Az MCP-1-tel töltött, növekedési faktorral csökkentett bazális membránból származó oldat elkészítése

JEGYZET: Ez egy steril eljárás.

2. Az alagsori membránból származó oldat injekciója

3. Az alapmembránból származó géldugó betakarítása

4. Emelje meg az alapmembránból származó géldugót

5. A sejtösszetétel meghatározása a sejtszuszpenzióban egysejtű Western blot (scWB) analízissel

6. Húzza ki az scWB chipet

Reprezentatív eredmények

A vér monociták kemolockáns reakciójának elérése érdekében vivőanyaggal és MCP-1-vel töltött deraste membránból származó oldatot injektáltunk minden egér bal és jobb oldalába. Az alapmembránból származó géldugókat eltávolítottuk, leválasztottuk és az egyes dugókba sejteket toboroztunk az injekció beadása után 1, 3 és 5 nappal (1A ábra). Ha levontuk a járművel töltött csatlakozóban lévő cellák számát (nyitott sávok) az MCP-1-vel töltött csatlakozóban lévő cellák számából (zárt sávok), megkaptuk azon cellák számát, amelyeket kifejezetten toboroztak az MCP-1-re válaszul (cellák száma, 1B ábra). Megfigyeltük az MCP-1 sejtek gyorsított toborzását és felhalmozódását az 5 napos periódus alatt, a sebesség 31 000 sejt/nap (1. nap) 78 000/nap (3. nap) és 136 000 sejt/nap értékre nőtt az 5. napon (1B. ábra).

Az itt bemutatott adatok statisztikai kiértékelését elemző szoftverrel (pl. SigmaPlot 14) végeztük. ANOVA-t, majd Fischer LSD-tesztet alkalmaztunk a kísérleti csoportok átlagainak összehasonlítására. Az összes adatot legalább 3 független kísérlet átlag SD-ként mutatjuk be. Az eredmények a P szinten voltak 1. ábra : Azok a sejtek számszerűsítése, amelyek az alagsorban szubkután dermembrán eredetű géldugókba toborozták akarat. (A.) Abszolút sejtszám a járművel töltött (nyitott rudak) és az MCP-1 terhelésű bazális membrán gél dugók (zárt oszlopok) esetében. (B.) Az MCP-1 által a pincemembránból származó géldugókba toborzott sejtek számát az MCP-1 és a vivőanyaggal töltött dugók közötti sejtszám különbségként számoltuk ki. Az eredmények átlag sD-ként jelennek meg (n = 4). Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

2. ábra : A bazális membránból származó géldugókba toborzott sejtpopulációk elemzése egysejtű Western blot elemzéssel voltak. (A + B) Reprezentatív példák egy járművel terhelt (Ellenőrzés) és egy MCP-1 lende csatlakozó (MCP-1Az egeretől három nappal az injekció beadása után izoláltuk. CD45, CD11b és F4/80 elleni antitestekkel jelölt chipek, majd fluoreszcens szekunder antitestek, a protokollban leírtak szerint. A jelölt sáv fluoreszcencia intenzitását minden egyes sejt esetében a csúcsterületként mutatjuk be. (C + D) A sejtpopulációkat monocitákként (CD11b + F4/80 -,), makrofágokként (CD11b + F4/80 + plusz CD11b - F4/80 +,) vagy nemmonocita leukocitákként (CD45 +) azonosítottuk. A fennmaradó cellákat "másoknak" () nevezték el. Az eredményeket átlag sD-ként mutatjuk be (n = 3). A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

3. ábra : A Dererampen géldugóinak monocita- és makrofágtartalma. A felvett monocita és makrofág szint kvantitatív elemzése a vivőanyaggal és MCP-1-gyel töltött dugókban az injekció után az 1., a 3. és az 5. napon. Az értékeket a teljes sejtpopuláció százalékában fejezzük ki (A + B) és az összekötőnkénti cellák abszolút számában (C +D.) jelenik meg. Az eredményeket átlag sD-ként mutatjuk be (n = 3). A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

Vita

Számos vizsgálati korlátot kell figyelembe venni. Először is, az egér manipulációja, beleértve az érzéstelenítést, a bazális membránból származó oldatok injekcióját és a műtéti rinz-t, gyakorlatot igényel az egyes dugók és reprodukálható adatok előállításához. Másodszor, míg az MCP-1-tel töltött dugókba toborzott sejtek többsége monocita és makrofág, jelentős részük nem. Ez befolyásolhatja az ezen a sejtpopuláción végzett más, nem egysejtalapú analitikai vizsgálatok értelmezését. Mivel az scWB sejtlízis körülményei enyheek, a fehérjék vándorlási távolságai eltérhetnek a standard WB-től, és nem korrelálnak a fehérje méretével. Ezért mind a sejt lízisét, mind a futtatás idejét minden egyes új vizsgálandó fehérjére és minden egyes primer antitestre érvényesíteni kell.