A pajzsmirigyhormonok és ezek sejtes hatásai, hatásmechanizmusai és kimutatási módszerei
Sejtes hatások, hatásmechanizmusok és pajzsmirigyhormonok és metabolitjaik kimutatási módszerei Értekezés az akadémiai fokozat megszerzéséhez doktor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) A biológiában Ina Lehmphul, a berlini Humboldt Egyetem élettudományi karához benyújtotta a tudománymester trofológus Humboldt University of Berlin Prof. Dr. Jan Hendrik Olbertz az Élettudományi Kar dékánja Prof. Dr. Richard Lucius bíráló: 1. Prof. Dr. Werner Kloas 2. Prof. Dr. Josef Köhrle 3. Prof. Dr. Jens Mittag A szóbeli vizsga napja: 2015. május 23
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék. I Rövidítések listája. V Az ábrák felsorolása. X Táblázatok listája. XI összefoglaló. XII. Absztrakt. XIII 1. Bevezetés. 1 1.1 A pajzsmirigy. 1 1.2 Pajzsmirigyhormonok (TH). 1 1.2.1 Bioszintézis. 1 1.2.2 Kiadás és szállítás. 3 1.3 Hypothalamus hipofízis pajzsmirigy tengelye (HPT). 4 1.4 A pajzsmirigyhormon anyagcseréje. 4 1.4.1 A pajzsmirigyhormonok metabolizmusa dejodázokkal. 4 1.4.2 Alternatív TH metabolizmus. 6 1.4.3 Az aktív TH T lokális és szisztémás hatásai 3. 7 1.5 Fontos TH metabolitok 3.5 T. 9 2 1.5.1 A 3.5 T 2. lokális és szisztémás hatásai 9 1.5.2 Szérumban és célsejtekben történő transzport . 10 1.5.3 TH metabolit receptorok. 10 1.5.4 Detektálási módszerek 3,5 T 2. esetén. 11 1.6 Fontos TH-metabolitok 3 T AM. 12 1 1.6.1 A 3 T 1 AM helyi és szisztémás hatásai. 12 1.6.2 Szállítás a szérumban és a célsejtbe. 13 1.6.3 TH metabolit receptorok. 13 1.6.4 A metabolit kimutatási módszerei. 14 1.7 Fontos TA-metabolitok TA 1 3 Tiroecetsav. 14 2. A munka célja. 17 2.1 A pajzsmirigy hormon metabolitjainak kimutatási módszere. 17 2.2 A pajzsmirigyhormonok metabolitjainak hatása a sejttenyésztési modellben. 17 3. Anyag. 18 3.1 Vegyszerek. 18 3.2 Eszközök. 18 I.
3.3 Fogyóeszközök. 18 3.3.1 Reagens készletek. 18 3.3.2 Pufferek és oldatok. 19 3.4 Adatbázisok. 20 3.5 Szoftver. 20 4. Módszerek. 23 4.1 Molekuláris biológiai módszerek. 23 4.1.1 RNS izolálás Trizollal. 23 4.1.2 cdna szintézis. 23 4.1.3 qpcr. 24 4.1.4 Alapozók. 25 4.2 Fehérje-biokémiai módszerek. 28 4.2.1 Bradford-elv. 28 4.2.2 Bradford megvalósítás. 28 4.3 Sejtkultúra. 29 4.3.1 Egér hasnyálmirigy MIN6 sejtvonal. 29 4.3.2 Humán hepatocelluláris HepG2 sejtvonal. 29 4.4 Citotoxicitás/sejtek életképességének vizsgálata. 29 4.4.1 MTT-vizsgálat NADPH-függő sejt-toxicitási vizsgálat. 4.4.1. A) A vizsgálat elve. 29 4.4.1 b) Végrehajtás. 30 4.4.2 ATP sejtek életképességi vizsgálata. 30 4.4.2. A) A vizsgálat elve. 30 4.4.2 b) Végrehajtás. 30 4.5 Sejtfelvétel/sejtfelszíni kötés 3 T 1 AM. 30 4.6 MIN6 sejtek extrahálása LC MS/MS elemzéshez. 31 4.7 MIN6 sejttenyészet felülúszók kivonása LC MS/MS analízishez. 32 4,8 LC LC/MS paraméterek. 32 4.8.1 Sejtkultúra sejtlizátumok AbSciex 4000 elemzése. 32 4.8.2. A sejttenyészet felülúszóinak AbSciex 6500 elemzése. 34 4.9 Glükóz-stimulált inzulin szekréció (GSIS). 36 4.10 A szubsztrát-specifikus energiaforgalom elemzése a Seahorse XF Bioanalyzer segítségével. 36 4.10.1 A mérés elve. 36 4.10.1. A) Mitokondriális légzés. 37 4.10.1. B) Glikolízis/szubsztrát anyagcsere. 39 II
Rövidítések listája C Celsius fok µ mikro µg mikrogramm µl mikroliter µm mikromoláris 2 DG 2 dezoxiglükóz 3 T 1 AM 3 jodotironamin AADC aromás L aminosav dekarboxiláz ábra Ábra AC adenilát-cikláz Adra 2α adrenerg receptor 2alpha ANO1 anok-oxid 1 apoptamin 1 AO amozin Mass index BSA szarvasmarha szérum albumin cDNS komplementer DNS CLIA Chemilumineszenez Immunoassay Ct ciklus treshhold COX citokróm C-oxidáz DC Dekarboxiláz Dehal dehalogenáz DEPC dietil-piro Dio Deiodase DIT 3,5 Diiodtyrosine DMEM Dubelcco s Modified EagleDesulfonX DNS NPHelcco anhidridet anaDyribulfonX DNS NPHelcco anaDyloxy anaDySulfonX DNS NADyribulfone éS Dual Oxidase ECAR extracelluláris savanyítási arány V.
EDC ELISA ERK EST FBS FCCP Etil-3 (3-dimetilaminopropil) -karbodiimid-enzimmel kapcsolt immunvizsgálat extracelluláris szabályozott kináz címkézett expresszált szekvencia borjúmagzatszérumot karbonil-cianid-p trifluoromethoxyphenylhydrazone ft 3/ft 4 szabadon/fehérjéhez nem kötött T 3/T 4 GPLC fwd g GaM FCR FPLC fwd g GaM FCR h H 2 OH 2 O 2 HbA 1 c HPLC HPRT HPT tengely HRP icv Ig i.p. Ipro i.v. kda KRBH Lat/LAT LCB LC MS/MS LDL m M mab gyors teljesítményű folyadékkromatográfia előre Gyorsulás antiegér IgG, Fc specifikus és biotinilált G fehérjéhez kapcsolt receptor glükózstimulált inzulin szekréció óra víz hidrogén-peroxid glikohemoglobin nagy teljesítményű folyadékkromatográfia hipoxantin guanin foszfor mirigymirigy ventrikuláris ventrikuláris ventrikuláris ventrikuláris ventrikuláris ventrikuláris ventrikulus intraperitoneális iproniazid intravénás kilodalton Krebs Ringer HEPES puffer L típusú aminosav transzporter alacsony kereszt puffer folyadékkromatográfia kapcsolt tandem tömegspektrometria alacsony sűrűségű lipoprotein milli moláris monoklonális antitest VI
MAPK Mct/MCT min MIN6 MTT mrna n NA NADH NADPH NaN 3 ND NEAA ng NIS nm nm NQ ns Ntcp/NTCP NTI Oatp/OATP OCR ON p pab PAI PB PBS PBST PCR PI3K POAF qpcr Mitogén által aktivált protein kináz transzkarbonát-karboxiát transzporter Sejtvonal egér 3 monojód-tirozin-tetrazolium-só messengerrna nano nem elemzett nikotinamid-adenin-dinukleotid-nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-nátrium-azid nem észlelt nem esszenciális aminosavak nanogramm nátrium-jodid-szimporter nanométer nanomoláris nem számszerűsítve nem szignifikáns Sóoldat Foszfáttal pufferolt sóoldat Tween-polimeráz láncreakcióval Foszfatidil-inozitol-3-kináz posztoperatív pitvari (szív) fibrilláció kvantitatív valós idejű PCR VII
rev RIA RNS fordulat/perc RQ rt 3 s.c. SD SDS sec SHIP Slc/SLC SULT T 0 T 1 T 2 T 3 T 4 TA TAE TAM TAAR TBG TCA Tg TH TBME TPO TRα TRβ TRE TRH TSH fordított radioimmunanalízis Ribonukleinsav fordulat/perc légzési hányados fordított 3,3,5 triiod L tironin szubkután pajzsmirigy-nátrium-dodecil-szulfát második egészségügyi tanulmány Pomerániaban tiroxin Thyroacetic sav Tris-acetát-EDTA-pufferben Thyronamine nyomaminasszociált receptort tiroxinkötő globulin trikarbonsav Thyroglobulin tironin, pajzsmirigyhormon-terc-butil-metil-éterrel thyreoid peroxidáz tiroid hormon receptor alfa tiroid hormon receptor 3/béta TH reszponzív elem tirotropin-felszabadító hormon 3/béta TH reszponzív elem tirotropin-felszabadító hormon 4/béta TH reagáló fehérjét 4 tirotropin-felszabadító hormon 4/béta-TH reagáló fehérjét 4 tirotropin-felszabadító hormon 4/béta-throid stimuláló protein 4 tirotropin-felszabadító hormon 4/béta-TH reagáló fehérjét Transztiretin VIII
VLDL vol% nagyon alacsony sűrűségű lipoprotein vol% IX
A célsejtbe történő transzport mechanizmusa ismert, és a sík membránreceptorok aktivációját még nem kellett megvizsgálni. 16.
2. táblázat: Gyakran használt reagenskészletek Reagenskészlet Absolute qpcr SYBR Green Mix Bio Rad Protein Assay Festékreagens koncentrátum CellTiter Glo Luminescent Cell Vability Assay RQ1 RNáz mentes DNS-t ImmunoPure MAb izotipizáló készlet Inzulin (egér) ultrahangos ELISA iscript Select cdna Synthesis Kit LowCross Protein Assay Kit PIERCE EZ Link Plus aktivált peroxidáz PIERCE SuperSignal ELISA Femto maximális érzékenységű szubsztrátum RIA rt 3 Sepharose r Protein A Slide A Lyzer dialízis kazetta 2K MWCO ThermoScript Reverse Transcriptase Trizol Gyártó Abgene (Epsom, Egyesült Királyság) Bio Rad Laboratories (München) Promega (Madison, WI, USA) Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, USA) DRG diagnosztika (Marburg) Bio Rad (München) Candor Biosciences (Wangen) Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) Thermo Scientific ( Waltham, MA, USA) Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) ZenTech SA (Belgium) GE Healthcare (Freiburg) Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, USA) Invitrogen (Karlsruhe) Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) 3.4 Adatbázisok A 4. táblázat bemutatja az összes felhasznált adatkezelési rendszert. 3.5 Szoftver Az 5. táblázat összefoglalja az ebben a munkában használt szoftvert. 20