A prenatális stressz hatása az ideghálózat mielinációjára és kialakulására
A prenatális stressz hatása a magzati juhagyban a mielinációra és az ideghálózat kialakulására Értekezés a doktori fokozatú medicinae (Dr. med) megszerzéséért, amelyet a Jena Friedrich Schiller Egyetem Orvostudományi Karának tanácsa adott be Julia Quendt, született szeptember 5-én. 1987-ben Gothában
Lektor: 1. Prof. Dr. med. Matthias Schwab/Jena 2. Prof. Dr. med. Richard Berger/Neuwied 3. PD Dr. med. Bernd Romeike/Jena közvédelem napja: 2014. május 6
Tartalom-jegyzék Tartalom-jegyzék A RÖVIDÍTÉSEK FELSOROLÁSA I 1 ÖSSZEFOGLALÓ 1 2 BEVEZETÉS 3 2.1 A prenatális stressz klinikai jelentősége a magzat számára 3 2.2 Magzati agy fejlődése 5 2.2.1 Embrionális agy fejlődése 5 2.2.2 Sejtek szaporodása és migráció 5 2.2.3 Neuronális és glia differenciálódás 6 2.2.4 Agyi mielináció 7 2.2.4.1 A mielinhüvely szerkezete és biokémiai összetétele 7 2.2.4.2 A mielinhüvely funkciója és jelentősége 9 2.2.4.3 Az oligodendrociták eredete és differenciálódása 10 2.2.4.4 A mielináció időbeli lefolyása 11 2.3 A prenatális stressz hatása a magzati agy fejlődésére 13 2.3.1 Az anyai stressz agyi hatásai 13 2.3.2 A prenatális glükokortikoid terápia agyi hatásai 14 2.3.3 A stressz tengelyének szabályozása 16 2.3.4 Az anyai stressz és a prenatális glükokortikoid terápia hatása a stressz tengelyének alakulására 18 2.4 A prenatális stressz hatásainak mechanizmusai 19 2.4.1 Anyai átvitel Stressz a magzatokon 19 2.4.2 A glükokortikoidok receptor által közvetített hatása 20 2.4.3 Prenatális stressz és növekedési hormonok 21 2.5 A munka célja 22
Tartalom 3 ANYAG ÉS MÓDSZEREK 25 3.1. 25. kísérlet 3.1.1. Kísérleti protokoll 25 3.1.2 A magzati agy megszerzése és a minták előállítása 27 3.2 Hisztokémiai és immunhisztokémiai festés 28 3.2.1 Áttekintés festés hematoxilin-eozinnal 28 3.2.2 Ezüst impregnálás Bielschowsky szerint 29 3.2.3 MBP immunohisztokémiai kimutatása 31 3.3 Fénymikroszkópos és PC-alapú értékelés 35 3.4 Statisztikai értékelés 39 4 EREDMÉNYEK 40 4.1 Testtömeg és agytömeg a prenatális stressz után 40 4.2 A prenatális stressz agyi hatásai 42 4.2.1 Idegsejtes folyamatok kialakulása a fehér anyagban 42 4.2.1.1 Szubkortikális fehéranyag 42 4.2.1.2 Corpus callosum 47 4.2.1.3 Mély fehér anyag corona radiata 49 4.2.1.4 Belső kapszula 51 4.2.2 Idegsejtek myelinációja a fehér anyagban 53 4.2.2.1 Kéreg alatti sub white white anyag 53 4.2.2.2 Corpus callosum 58 4.2.2.3 Mély fehér anyag - Corona radiata 60 4.2.2.4 Capsula interna 62 4.2.3 Forma Neuronális struktúrák kialakulása a hippocampusban (CA3 régió) 64
Tartalom 5 MEGBESZÉLÉS 69 5.1 A módszerek ismertetése 69 5.1.1 Állati modell 69 5.1.2 Stressz modell 70 5.1.3 Szövettan 72 5.1.4 Kvantitatív képelemzés 74 5.2 Az eredmények megbeszélése 75 5.2.1 Prenatális stressz és a magzat növekedése 75 5.2.2 A prenatális stressz hatása a hippocampusra 78 5.2.3 Prenatális stressz utáni agyi hatások az ideghálózatra 79 5.2.4 Agyi hatások a prenatális stressz után a mielinációra 82 6 KÖVETKEZTETÉSEK 84 7 IRODALOM ÉS HIVATKOZÁSOK 86 8 FÜGGELÉK 102 8.1 Köszönetnyilvánítás 103
Rövidítések listája Rövidítések listája ABC ACTH ADHD AK AP + T AP + T + S Aqua dest. AVP BM CNP (p) crh GR GT HE HHN tengely 11ß-HSD2 IGF MAG MBP MOG MR MW OMgp PBS PLP REM RT SEM SSW Avidin-Biotin-Complex Adrenokortikotrop hormon Figyelemhiány/hiperaktivitási rendellenesség Antitest munkapuffer Munkapuffer + Triton-X-100 munkapuffer + Triton + Serum Aqua distillata (desztillált víz) arginin-vazopresszin-betametazon 2-3 -Ciklusos nukleotid-3 -foszfohidroláz (placenta) kortikotropin-felszabadító hormon glükokortikoid receptor terhesség napja (i) hematoxilin-eozin hipotalamusz-hipofízis tengely 11. tengely 2-es típusú hidroxi-szteroid-dehidrogenáz
2 Perventricularis leucomalacia (a fehéranyag károsodása koraszülés közben) kiváltása a terhesség 0,65 időpontjában (ami megfelel az emberi magzat 24. és 28. terhességi hetének), ami a magzati juhok és az emberek közötti agyfejlődés magas szintű összehasonlíthatóságát jelenti. Ezt támasztotta alá az a tény, hogy ebben az időablakban megkezdődik az oligodendrocyták érése a juhok magzati agyában, és ezzel egyidejűleg a korai csecsemőknél megfigyelhető az éretlen, periventrikuláris, fehérállomány károsodásának nagy kockázata (Back et al. 2006, 2001) . A születés idején a létrehozott személy agya valamivel magasabb érettséget mutat, mint az embereké (McIntosh et al. 1979, Astrom 1967). Ez azt sugallhatja, hogy a kreatív elme gyorsabban érik az utolsó trimeszterben. 12.
2 Bevezetés összehangolt fiziológiai válasz a különböző kortizol-koncentrációkra (2.4.2. Fejezet). 2.3. Ábra: Hypothalamus-hipofízis-mellékvese tengely és a negatív visszacsatolás útjai. Kortikotropint felszabadító hormon (CRH), arginin vazopresszin (AVP), proopiomelanokortin (POMC), adrenokortikotrop hormon (ACTH), paraventrikuláris sejtmag (NPV). Módosítva: Metthews 2002. 17
2 A bevezetés az agy fejlődésének időbeli lefolyását mutatja, hasonlóan az emberekéhez, még akkor is, ha kissé gyorsabban érik. Összességében 45 munkavállaló agyát értékelték, akik krónikus stresszt szenvedtek a 0,20-0,66 terhesség (30.-100. BT) között azzal, hogy heti két napon 180 percig izolálták őket. Mivel a juhok állományállatok, ezért az izoláció jelentõs stressztényezõ e faj számára. A lehetséges tartós hatások kimutatása érdekében az agyakat 0,73-nál (110. GT, terhességi időtartam 150 nap) és 0,86-os terhességnél (130. GT) értékeltük. Az eredmények célja, hogy segítsenek tisztázni a prenatális stressz agyi működésre gyakorolt hatásait a későbbi életben. 24.
3 Anyagok és módszerek Más állatok hallótávolságán belül elkülönítve, így a protokoll végén minden állatot 20-szor külön izolátumnak tettünk ki. Mivel a juh állományállatok, különösen érzékenyek erre a stresszorra. A kortizolszint izolálás előtti és alatti mérései igazolni tudták ezt a hatást (Rakers et al. 2012). Stresszcsoport Kontrollcsoport Az ivarzási ciklus szinkronizálása és az ütemezett párosodás ÖSSZEHASONLÍTÁSBAN Megfelelő szabad tartás a pásztornál Vemhes állatok szállítása vizsgálati laboratóriumba Stressz izolálás útján hetente 2 alkalommal 3 órán át Krónikus műszer Magzati agy megszerzése - 1. csoport Magzati agy megszerzése - 2. csoport Természetes esedékesség ábra .3.1: Kísérleti protokoll A 100. és a 110. GT között a magzatokat katéterekkel műszerezték, amelyeket az intrauterin stressz válaszok (ACTH és kortizol felszabadulás) ellenőrzésére használtak. Értékelésük nem a munka tárgya (lásd Rakers 2012). A kísérletek befejezése és a magzatok operatív fejlesztése után meghatározták testük és agyuk súlyát. Ezeket a méréseket 26-án végeztük
3 A felszálló alkohol sorozat anyagai és módszerei dehidratálva és Neo-Mount szerelőközeggel lezárva (MERCK GmbH, Darmstadt, Németország). A festés részletes protokollja a 3.2. Táblázatban található. Közepes viaszmentesítés: 2x Neoclear 2x izopropanol 100% 1x izopropanol 80% 1x izopropanol 50% desztillált víz. Ezüst impregnálás: AgNO 3 20% 2x aqua dest. Ammóniás ezüst-nitrát oldat desztillált víz + nh 3 (4: 1) Na tioszulfát 5% csapvíz desztillált víz. Dehidratálás: izopropanol 50% izopropanol 80% 2x izopropanol 100% 2x neoclear balzsam inklúzió Entellan idővel [perc]/hőmérséklet [C] 10/RT 5/RT 5/RT 5/RT 3/RT 90/37 30/45 1- 3/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT 3.2. Táblázat: Protokoll az ezüst impregnálására Bielschowsky szerint. RT szobahőmérséklet. Az oldatokat az alábbiak szerint állítjuk elő: 20% ezüst-nitrát oldat (AgNO 3): 100 ml desztillált víz. + 20 g ezüst-nitrát, 5% -os nátrium-tioszulfát (Na 2 S 2 O 3): 100 ml desztillált víz. + 5 g nátrium-tioszulfát Előkészítés a fejlesztői oldathoz: 25 ml desztillált víz. + 125 mg citromsav (Fluka Chemie, Buchs, Németország) + 5 ml 36% formalin (Carl ROTH GmbH, Karlsruhe, Németország) + 8 µl tömény salétromsav-ENT 3 (Fluka Chemie, Buchs, Németország). 30-án
3 Anyag és módszerek 2xAP + T ABC komplex: AP + T + oldatA + oldatB AP + T 2x PBS desztillált víz. 3'3-diaminobenzidin (DAB) 2x aqua dest. Dehidrálás: izopropanol 50% izopropanol 80% 2x izopropanol 100% 2x Neoclear 100% balzsam inklúzió Entellan 5/RT 60/37 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT Az A és B oldat 20 µl-je 1 ml AP + T 1Set-ben (H2O2 + DAB) 5 ml desztillált vízhez, szűrés Millipore-szűrővel 3.3. Táblázat: Protokoll az MBP immunohistikémiai kimutatására. Az oldatokat az alábbiak szerint állítjuk elő: Citrátpuffer: 1 liter desztillált víz. + 2,94 g nátrium-citrát (Fluka Chemie, Buchs, Németország), pH 6,0. PBS: 1 liter desztillált víz. + 1 g D-PBS munkapuffer: 500 ml PBS + 2,5 g szarvasmarha-szérumalbumin (szarvasmarha-szérumból származó albumin, minimum 98%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Németország) + 250 µl TWEEN 20 (poli (oxi-etilén-szorbitán) -monolaurát) (Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Németország) ph 7.5. DAB oldat (Sigma Fast DAB szubsztrát): 2 tabletta (karbamid-hidrogén-peroxid és 3,3-diaminobenzidin) 5 ml desztillált vízben. addig kavargassa, amíg a kész tabletták teljesen fel nem oldódnak. 34
3 Anyag és módszer 3.3. Ábra: A HE áttekintő festés módosítva, a The Sheep Brain Atlas szerint, Michigan State Unversity Brain Biodiversity Bank, National Science Foundation. https://www.msu.edu/
agy/agy/juh/index.html, 2012.02.15. Balra: Szubkortikális fehérállomány a frontális kéregben: a kéreg közelében [1] és a kéregtől távol [2]; Corpus callosum [3]; Corona radiata [4]; Belső kapszula [5]; SV: oldalsó kamra. Jobbra: CA3 régió a hippocampusban: ventrális szakasz [1], háti szakasz [2] 36
3 Anyag és módszerek A digitális tárolás után a felvételeket képfeldolgozó programban értékelték (Scion Image 1.62 NIH, USA). Először a színes képeket fekete-fehér képekké alakították át, 256 szürke szinttel. Képelemzéssel határoztuk meg a reprezentatív szakaszon belüli pozitív jelölés területét. Az immunjelölés/ezüst impregnálás területe tükrözi az antigén/sejt sejtsűrűség immunhisztokémiai eloszlását. A mikroszkópos képhez képest egy felső és egy alsó küszöbértéket állítottunk be vizuális ellenőrzés alatt. Ezek a küszöbértékek tartományt alkotnak a pozitív MBP immunreaktivitás vagy az ezüstszínű idegrostok szelektív ábrázolásához. (lásd 3.4. ábra, piros jelölés). 3.4. Ábra: Képelemzés a szürke értékek segítségével A: Mikroszkópos kép: Neuronális folyamatok a kéregtől távoli frontális kéreg szubkortikális fehérállományában. 37
3 Anyag és módszerek B: A festett sejthosszabbítások megjelölése a szürkeárnyalatos képen A mikroszkópos képhez képest a szürkeárnyalatos képen egy szürke terület van meghatározva (a képen pirossal jelölve), amely megfelel az ezüst impregnálás pozitív jelének. Ezt a területet a képelemző program méri. 38