A prenatális stressz hatása az ideghálózat mielinációjára és kialakulására

1 A prenatális stressz hatása a magzati juhagyban a mielinációra és az ideghálózat kialakulására Értekezés a Jena Friedrich Schiller Egyetem Orvostudományi Karának Tanácsához benyújtott Julia Quendt, született 05.05. 1987. szeptember Gothában

2 lektor: 1. Prof. Dr. med. Matthias Schwab/Jena 2. Prof. Dr. med. Richard Berger/Neuwied 3. PD Dr. med. Bernd Romeike/Jena közvédelem napja:

3 Tartalom Tartalom I A RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 1 1 ÖSSZEFOGLALÓ 1 2 BEVEZETÉS A prenatális stressz klinikai jelentősége a magzat számára A prenatális stressz mielinációja a magzati agy fejlődésére Az anyai stressz agyi hatásai A prenatális glükokortikoid terápia agyi hatásai A stressz tengelyének szabályozása Az anyai stressz és a prenatális glükokortikoid terápia hatása a stressz tengelyének kialakulására glükokortikoidok Prenatális stressz és növekedési hormonok Az értekezés célja 22

4 Tartalom 3 ANYAG ÉS MÓDSZER Kísérleti kísérleti protokoll A magzati agy kivonása és a minták előkészítése Hisztokémiai és immunhisztokémiai festés prenatális stressz prenatális stressz idegi folyamatok kialakulásának agyi hatásai a fehérállományban subkortikális fehérállomány corpus callosum mélyfehér anyag corona radiata capsula interna idegi folyamatok mielinációja a fehéranyagban subcorticalis fehér anyag corpus callosum mélyfehér anyag - corona radiata capsula interna idegstruktúrák kialakulása a Hippocampus (CA3 régió) 64

5 Tartalomjegyzék 5 MEGBESZÉLÉS A módszerek tárgyalása állatmodell Stressz modell Szövettan Kvantitatív képanalízis Az eredmények megbeszélése Prenatális stressz és magzati növekedés Prenatális stressz utáni hatások a hippocampusra Agyi hatások prenatális stressz után az ideghálózatra agyi hatások a mielináció előtti prenatális stressz után 82 6 KÖVETKEZTETÉSEK 84 7 LITERALS 8 FÜGGELÉK Köszönetnyilatkozat a becsületről 103

6 Rövidítések listája Rövidítések listája ABC ACTH ADHD AK AP AP + T AP + T + S Aqua dest. AVP BM CNP (p) crh GR GT HE HHN tengely 11ß-HSD2 IGF MAG MBP MOG MR MW OMgp PBS PLP REM RT SEM SSW Avidin-Biotin-Complex Adrenokortikotrop hormon Figyelemhiány/hiperaktivitási rendellenesség Antitest munkapuffer Munkapuffer + Triton-X-100 munkapuffer + Triton + Serum Aqua distillata (desztillált víz) arginin-vazopresszin-betametazon 2-3 -Ciklusos nukleotid-3 -foszfohidroláz (placenta) kortikotropin-felszabadító hormon glükokortikoid receptor terhesség napja (i) hematoxilin-eozin hipotalamusz-hipofízis tengely 11. tengely 2-es típusú hidroxi-szteroid-dehidrogenáz

18 2 A perventricularis leucomalacia (a fehéranyag károsodása koraszülés közben) kiváltása a terhesség 0,65 órája körül (amely megfelel az emberi magzat terhességi hetének), ami a magzati juhok és az emberek közötti agyfejlődés nagyfokú összehasonlíthatóságát jelenti. Ezt támasztotta alá az a tény, hogy ebben az időablakban megkezdődik az oligodendrocyták érése a juhok magzati agyában, és ezzel egyidejűleg a korai csecsemőknél megfigyelhető az éretlen, periventrikuláris, fehérállomány károsodásának nagy kockázata (Back et al. 2006, 2001) . A születés idején a létrehozott személy agya valamivel magasabb érettséget mutat, mint az embereké (McIntosh et al. 1979, Astrom 1967). Ez azt sugallhatja, hogy a kreatív elme gyorsabban érik az utolsó trimeszterben. 12.

23 2 Bevezetés összehangolt fiziológiai válasz a különböző kortizol-koncentrációkra (2.4.2. Fejezet). 2.3. Ábra: Hypothalamus-hipofízis-mellékvese tengely és a negatív visszacsatolás útjai. Kortikotropint felszabadító hormon (CRH), arginin vazopresszin (AVP), proopiomelanokortin (POMC), adrenokortikotrop hormon (ACTH), paraventrikuláris sejtmag (NPV). Módosította a Metthews

30 2 A bevezetés az agy fejlődésének hasonló időbeli lefolyását mutatja, mint az emberek, még akkor is, ha kissé gyorsabban érik meg. Összességében 45 munkavállaló agyát értékelték, akik krónikus stresszt szenvedtek a 0,20–0,66 terhesség (GT) között a heti két nap 180 perces izolációjától kezdve. Mivel a juhok állományállatok, ezért az izoláció jelentõs stressztényezõ e faj számára. A lehetséges tartós hatások kimutatása érdekében az agyakat 0,73-nál (110. GT, terhességi időtartam 150 nap) és 0,86-os terhességnél (130. GT) értékeltük. Az eredmények célja, hogy segítsenek tisztázni a prenatális stressz agyi működésre gyakorolt hatásait a későbbi életben. 24.

32 3 Anyagok és módszerek Más állatok hallótávolságában vannak elkülönítve, így a protokoll végén minden állatot 20-szor külön izolálták. Mivel a juh állományállatok, különösen érzékenyek erre a stresszorra. A kortizolszint izolálás előtti és alatti mérései igazolni tudták ezt a hatást (Rakers et al. 2012). Stresszcsoport Kontrollcsoport Az ivarzási ciklus szinkronizálása és az ütemezett párosodás ÖSSZEHASONLÍTÁSBAN Megfelelő szabad tartás a pásztornál Vemhes állatok szállítása vizsgálati laboratóriumba Stressz izolálás útján hetente 2 alkalommal 3 órán át Krónikus műszer Magzati agy megszerzése - 1. csoport Magzati agy megszerzése - 2. csoport Természetes esedékesség ábra .3.1: Kísérleti protokoll A 100. és a 110. GT között a magzatokat katéterekkel műszerezték, amelyeket az intrauterin stressz válaszok (ACTH és kortizol felszabadulás) ellenőrzésére használtak. Értékelésük nem a munka tárgya (lásd Rakers 2012). A kísérletek befejezése és a magzatok operatív fejlesztése után meghatározták testük és agyuk súlyát. Ezeket a méréseket 26-án végeztük

36 3 A felszálló alkohol sorozat anyagai és módszerei dehidratálva és rögzítő közeggel bezárva Neo-Mount (MERCK GmbH, Darmstadt, Németország). A festés részletes protokollja a 3.2. Táblázatban található. Közepes viaszmentesítés: 2x Neoclear 2x izopropanol 100% 1x izopropanol 80% 1x izopropanol 50% desztillált víz. Ezüst impregnálás: AgNO 3 20% 2x aqua dest. Ammóniás ezüst-nitrát oldat desztillált víz + nh 3 (4: 1) Na tioszulfát 5% csapvíz desztillált víz. Dehidráció: izopropanol 50% izopropanol 80% 2x izopropanol 100% 2x Neoclear balzsam inklúzió entellán idővel [perc]/hőmérséklet [C] 10/RT 5/RT 5/RT 5/RT 3/RT 90///RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT 3.2. Táblázat: Bielschowsky szerinti protokoll az ezüst impregnálására. RT szobahőmérséklet. Az oldatokat az alábbiak szerint állítjuk elő: 20% ezüst-nitrát oldat (AgNO 3): 100 ml desztillált víz g ezüst-nitrát 5% -os nátrium-tioszulfát (Na 2 S 2 O 3): 100 ml desztillált víz. + 5 g nátrium-tioszulfát a fejlesztői oldathoz: 25 ml desztillált víz, mg citromsav (Fluka Chemie, Buchs, Németország) + 5 ml 36% formalin (Carl ROTH GmbH, Karlsruhe, Németország) + 8 µl tömény salétromsav HNO 3 (Fluka Chemie, Buchs, Németország). 30-án

40 3 Anyag és módszerek 2xAP + T ABC komplex: AP + T + oldatA + oldatB AP + T 2x PBS desztillált víz. 3'3-diaminobenzidin (DAB) 2x aqua dest. Dehidrálás: izopropanol 50% izopropanol 80% 2x izopropanol 100% 2x Neoclear 100% balzsam inklúzió Entellan 5/RT 60/37 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT Az A és B oldat 20 µl-je 1 ml AP + T 1Set-ben (H2O2 + DAB) 5 ml desztillált vízhez, szűrés Millipore-szűrővel 3.3. Táblázat: Protokoll az MBP immunohistikémiai kimutatására. Az oldatokat az alábbiak szerint állítjuk elő: Citrátpuffer: 1 liter desztillált víz. + 2,94 g nátrium-citrát (Fluka Chemie, Buchs, Németország), pH 6,0. PBS: 1 liter desztillált víz. + 1 g D-PBS munkapuffer: 500 ml PBS + 2,5 g szarvasmarha-szérumalbumin (szarvasmarha-szérumból származó albumin, minimum 98%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Németország) µl TWEEN 20 (polioxietilén-szorbitán-monolaurát) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Németország) ph 7.5. DAB oldat (Sigma Fast DAB szubsztrát): 2 tabletta (karbamid-hidrogén-peroxid és 3,3-diaminobenzidin) 5 ml desztillált vízben. addig kavargassa, amíg a kész tabletták teljesen fel nem oldódnak. 34

42 3 Anyagok és módszerek 3.3. Ábra: H&E áttekintő festés módosítva, a The Sheep Brain Atlas szerint, Michigan State Unversity Brain Biodiversity Bank, National Science Foundation Left: Subkortikális fehérállomány a frontális kéregben: a kéreg közelében [1] és távol a kéregtől [2]; Corpus callosum [3]; Corona radiata [4]; Belső kapszula [5]; SV: oldalsó kamra. Jobbra: CA3 régió a hippocampusban: ventrális szakasz [1], háti szakasz [2] 36

3 3 Anyag és módszerek A digitális tárolás után a felvételeket képfeldolgozó programban értékelték (Scion Image 1.62 NIH, USA). Először a színes képeket fekete-fehér képekké alakították át, 256 szürke szinttel. Képelemzéssel határoztuk meg a reprezentatív szakaszon belüli pozitív jelölés területét. Az immunjelölés/ezüst impregnálás területe tükrözi az antigén/sejt sejtsűrűség immunhisztokémiai eloszlását. A mikroszkópos képhez képest egy felső és egy alsó küszöbértéket állítottunk be vizuális ellenőrzés alatt. Ezek a küszöbértékek tartományt alkotnak a pozitív MBP immunreaktivitás vagy az ezüstszínű idegrostok szelektív ábrázolásához. (lásd 3.4. ábra, piros jelölés). 3.4. Ábra: Képelemzés a szürke értékek segítségével A: Mikroszkópos kép: Neuronális folyamatok a kéregtől távoli frontális kéreg szubkortikális fehérállományában. 37

44 3 Anyag és módszerek B: A festett sejthosszabbítások megjelölése a szürkeárnyalatos képen A mikroszkópos képhez képest a szürkeárnyalatos képen egy szürke területet határozunk meg (a képen pirossal jelölve), amely megfelel az ezüst impregnálás pozitív jelének. Ezt a területet a képelemző program méri. 38

61 MBP-IR területe [10-3 mm²] 4 eredmény Szubkortikális fehérállomány - a kéreg közelében 1,00 0,50 $$$ $$$ (n = 9) (n = 11) Kontroll stressz (n = 15) (n = 10) 0, terhességi kor [d] 4.18. Ábra: Az életkor és a stressz hatása az agykéreg melletti frontális kéreg szubkortikális fehérállományának idegsejtjeinek mielinációjára. MW ± SEM. $$$ p 62 4 Eredmények A kéregtől távol eső szubkortikális fehérállomány sejtjei és idegfolyamatai egyértelműen MBP-pozitívnak vannak jelölve (4.19. ábra). 4.19. Ábra: A kéregtől távoli frontális kéreg szubkortikális fehérállományának idegi folyamatainak mikrofotói. Az MBP immunohisztokémiai kimutatása. Neuronális folyamat A sejt test: kontroll állat a terhesség 110. napján B: stressz állat a terhesség 110. napján

72 Ezüst impregnálási terület [10-3 mm²] 4 eredmény 1,50 Hippocampus- CA 3 régió, ventrális szakasz 1,00 $ 0,50 (n = 9) (n = 7) (n = 6) * (n = 8 ) Kontroll stressz 0, terhességi kor [d] 42. ábra: Az életkor és a stressz hatása az ideghálózatra a hippocampus CA3 régióban, ventrális szakasz. MW ± SEM; * p 73 4 Eredmények 4.30. ábra: A hippocampus CA3 régió dorzális szakaszának idegsejt-szerkezetének mikrofotói. Ezüst impregnálás. Sejt maggal Neuronális folyamat A: kontrollállat a terhesség 110. napján B: stresszállat a terhesség 110. napján C: kontrollállat a terhesség 130. napján D: stresszállat a terhesség 130. napján