A rágcsáló zsírraktárainak lokalizálása, azonosítása és kivágása (német nyelvre fordítva)
Összegzés
Az elhízás és más társbetegségek közötti drasztikus és negatív kapcsolat miatt indokolt kutatni a zsírszövet betegségekben és az egészségi állapotban betöltött szerepét. Bemutatunk egy protokollt a zsírszövetraktárak elkülönítésére és eltávolítására, amely lehetővé teszi a zsírszövet vizsgálatát in situ és in vitro módszerekkel.
Bevezetés
Az elhízás figyelemre méltó szerepet játszott a média reflektorfényében, az elhízás 20. század utolsó évtizedeiben tapasztalt drámai növekedése miatt. Az elhízás jelenleg a felnőttek több mint egyharmadát, valamint a gyermekek és serdülők 17% -át érinti az Egyesült Államokban (USA) 1. Az elhízási járvány körüli statisztikai kutatások azt mutatják, hogy az etnikumok körében a nem spanyol feketék a legmagasabb az életkorhoz igazított elhízási ráta (49,5%) az összes spanyol (39,1%) mexikói-amerikaiakkal (40,4%) és a nem spanyol fehérekkel (34,3%) szemben. 2. Az elhízás gazdasági hatása az egészségügyi rendszer iránti növekvő érdeklődés is. 2012-ben becslések szerint az elhízásellátás éves orvosi költségei az Egyesült Államokban 2005-ben 190,2 milliárd dollárt tettek ki, ami a teljes egészségügyi kiadások közel 21% -a. A gyermekkori elhízás sajnos csak a közvetlen orvosi költségek 14 milliárd dollárért felel. Statisztikailag megállapították, hogy a túlsúlyos személyek átlagos orvosi költsége évente 2741 dollár volt magasabb, mint a 3-5 morbiditást nem szenvedőké.
Az elhízás fontos kockázati tényező számos betegségben, például: 2-es típusú cukorbetegség, lipidanyagcsere-rendellenességek, szív- és érrendszeri betegségek, rák, mozgásszervi betegségek és krónikus gyulladások. Az elhízás mélyen összefügg a metabolikus szindróma és más krónikus betegségek patogenezisével. Az elhízás és más társbetegségek közötti ilyen drasztikus és negatív kapcsolatok mellett a tudományos kutatások a jelenlegi járványra és a zsírszövet sokszínű és döntő szerepére összpontosították a jobb megértést.
Történelmileg a zsírszövetet jelentéktelennek tekintették, és csupán egyszerű töltőszövetnek tekintették. Jelenleg a zsírszövet számos fontos szerepet játszik a szervezet működésében: anyagcsere, hormonális egyensúly, gyulladás, védelem és izolálás 9. A zsírszövet elsősorban adipocitákból áll, de tartalmaz pericitákat, endothel sejteket, monocitákat, makrofágokat és pluripotens őssejteket. 8. A zsírszövet adipocitákból áll a testen keresztül elosztva különböző depókban. A főbb raktárak megtalálhatók subdermálisan, szubkután, intramuszkulárisan és zsigeri úton. 10. A zsírraktárak depó specifikus anyagprofilokkal rendelkeznek, amelyek depó specifikus hajlamot mutatnak az elhízásra és a kapcsolódó rendellenességekre 8.
Hagyományosan a zsírszövetet két fő típusba sorolták: fehér zsírszövet (WAT) és barna zsírszövet (BAT); bár a legújabb szakirodalom egy harmadik csoport megkeresztelt brite vagy bézs zsírszövet jelenlétét mutatja 11. A zsírszövet morfológiájához, metabolikus funkcióihoz, biokémiai tulajdonságaihoz és genetikai expressziós mintáihoz kapcsolódó különböző színűek 10. A WAT-ban lévő adipociták egyetlen, nagy zsírcsepp és változó mennyiségű mitokondrium. WATdomináns található a test szubkután és zsigeri lokalitásában. A WAT elsősorban az energiatárolás és a szervvédelem helyeként működik. A BAT adipocitáinak multilokuláris morfológiája és bőséges mitokondriumai vannak. A BAT elsősorban a mellkas nyakában és nagy erekben, valamint a 12 lapockában található. A BAT elsősorban a termogenezist szabályozó energiafogyasztó viselkedésben működik 7. Kimutatták, hogy a brit vagy bézs zsírszövet hasonló morfológiával és expresszióval rendelkezik a BAT-on, de kimutatták, hogy fehér zsírsejtekből származik 11.
A protokoll célja pontos módszer biztosítása a különböző típusú zsírlerakódások azonosítására és izolálására több anatómiai helyről.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
MEGJEGYZÉS: Minden állatkísérletet a Cincinnati Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának (IACUC) jóváhagyásával és a Laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó Országos Egészségügyi Intézetek útmutatójának (NIH 85–23. Kiadvány) összhangban végeztek., Felülvizsgált 1996).
1. Eutanizálja és sterilizálja az egeret
- Helyezze az egeret egy szuperaputikus izoflurán adagból készült cseppdobozba, és hagyja, hogy a hatás belélegezzen. Miután az egeret elpusztította, távolítsa el a mezőről.
- A méhnyak eltolása mint az eutanázia második eszköze.
- Sterilizálja az egér külső felületét az állat 70% -os etanollal történő tisztításával.
2. Három különböző zsírszövetraktár azonosítása és izolálása
3. A perivaszkuláris zsírszövet (PVAt) izolálása
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
Az inguinalis subcutan zsírszövet, interscapularis barna zsírszövet, zsigeri zsírszövet epididymis azonosítása és lokalizálása (1. ábra) valamint az aortaív, a perivaszkuláris zsírszövet, a mellkasi aorta zsírszövet, a szomszédos aorta zsírszövet és az infrarenalis zsírszövet (2. ábra) a leírt műtéti módszerrel sikeresen sikerült elérni. A szövettani vizsgálat és a BAT és WAT minták közötti különbségtétel pozitív volt hematoxilin és eozin (H&E) festéssel (3. ábra) névleges. Az RNS adiponektin (ADIPOQ), a peroxiszóma proliferátor által aktivált gamma receptor (PPAR-γ), a sejthalált kiváltó DFFA-szerű effektor a (CIDEA) és más zsírspecifikus markerek elemzését a fenti izolált és kivágott depók mindegyikéhez mértük (az adatokat nem mutatjuk be).
A szubkután zsírsejtekből és a perivaszkuláris adipocitákból származó primer sejtvonalakat tenyésztettük és preadipocitákról adipocitákra differenciáltuk a mikroarray elemzés céljából. A tenyésztett preadipocitákat olajvörös O-festéssel átalakítottuk adipocitákká (4. ábra) jóváhagyott. A zsírsejtek sikeres izolálását, tenyésztését és differenciálódását elértük az in vitro vizsgálatokban való felhasználáshoz, és a fehérje aktivitást sikeresen mértük. A mátrix metaloproteáz-2 (MMP-2) enzimatikus aktivitását egy kezelési csoportban mértük a kontrollhoz képest. Az MMP-2 aktivitását in situ primer perivascularis adipocita vonalban határoztuk meg zymográfiával (5. ábra) mért.
Vita
Az elhízás sokféle társbetegséghez vezethet, és az elhízás szerepének teljes megértését nem teljesen értik; ezért további kutatások szükségesek az elhízás területén. Az állatmodellek, különösen az egérmodellek, ideálisak a betegség előrehaladásának előzetes kutatásához és a lehetséges gyógyszeres kezelések teszteléséhez. E modellek alkalmazásakor a zsírszövet-lerakódások pontos elválasztása és eltávolítása rendkívül fontos és szükséges eszköz a betegségeket érintő zsírszövet patológiájának tanulmányozásában.
Az elhízott lerakódásokról szóló jelenlegi szakirodalomban jelentős mennyiségű irodalom található az anyagcsere-viselkedésről, valamint az elhízott lerakódások és anatómiai elhelyezkedésük közötti különbségekről. Kevesen kínálnak azonban alapos módszert ezen raktárak konkrét felkutatására, azonosítására és elkülönítésére. A zsírszövetből származó jelenlegi izolálási eljárások áttekintése alapján a protokollok egy kis részcsoportja nyújt módszertant arra, hogyan lehet egyszerre egy vagy két depót elkülöníteni. Pontos technika, amely lehetővé teszi több depó izolálását minimális előkészítés és szennyezés mellett, valamint a gyűjtött minták vizsgálatának különböző módszereivel foglalkozik, ez a 13-14.
Ebben a módszerben több lépés létezik, amelyek kritikusak a minta izolálása és tisztasága szempontjából. Az eszközök, kesztyűk és felületek tisztítása, gyakran a szőr és a törmelék eltávolítása érdekében, elengedhetetlen lépés a raktár szennyeződésének elkerülése érdekében. Amikor az egér kerületén levágja a bőrt, hogy a peritoneum kiszabaduljon degloving céljából, fontos, hogy ne hagyjon túl mélyre semmit. A hashártya levágása nagyon megnehezíti a deglovingot, és növeli a minta szennyeződésének lehetőségét. Az SQ zsírszövetraktár kivágásakor fontos, hogy a zsír bármelyikének kivágása előtt meg kell határozni a depó háromszög alakú határait. A vágásokat óvatosan kell elvégezni, hogy elkerüljük az izmokat és a szomszédos ereket, mirigyeket és zsírszöveteket. Ez megakadályozza a minta szennyeződését alternatív zsírszövetből, mirigyszövetből, izmokból vagy vérből.
A zsírszövetraktárak izolálásának és kivágásának legfőbb korlátozása ebben az eljárásban és más összehasonlítható eljárások megtalálhatók bizonyos depók határainak meghatározásában. A rosszul meghatározott határok miatt a depókban, például a szubkután depókban, nehéz lehet kis mennyiségű szennyeződést elkülöníteni a szomszédos zsírtól. Egy másik korlátozás megtalálható abban, hogy elegendő szövet gyűlt össze az érrendszerrel összekapcsolt depókon a kiegészítő kísérletekhez. Ez a korlátozás néha a minták összevonását igényli, bár az izoláció helyétől és az állattal kapcsolatos tápláléktól függ.
A zsírszövetraktárak elkülönítése után különféle vizsgálatokhoz felhasználhatók. A zsírszövet alkalmazható molekuláris vizsgálatokhoz, például fehérje expresszióhoz, enzimaktivitáshoz és gén expresszió elemzéshez. Ezenkívül egy adipocita izolálhatja az elsődleges sejtvonal in vitro vizsgálatát. Az immortalizált sejtvonalak in vitro vizsgálatokhoz is felhasználhatók, azonban a halhatatlan sejtek nem annyira hitelesek, mint elsősorban különálló sejtvonalak. Végül a zsírszövet szilárd vagy fagyasztott lehet OCT-ben szövettani vizsgálat céljából, a leukocita infiltráció, a fehérje lokalizáció és az adipocita morfológia jellemzésének azonosítására.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.