A zebrafish embriók protokoll metabolikus profiljának elemzése (francia nyelvre fordítva)

Összegzés

A zebrafish egy erőteljes gerinces modellt alkot, amelyet nem használtak fel metabolikus vizsgálatokhoz. Itt leírjuk a zebrafish fejlődés in vivo metabolikus profiljának mérésének gyors módját, amely lehetővé teszi a mitokondriális funkció különböző paramétereinek összehasonlítását genetikailag vagy farmakológiailag módosított embriók között, ezáltal növelve ennek a szervezetnek az alkalmazhatóságát.

Absztrakt

Jegyzőkönyv

1. rész: A zebrafish embriók kémiai kezelése

  1. A megtermékenyítés után gyűjtsük össze a zebrafish embriókat. Inkubáljuk 28,5 ° C-on E3-táptalajban 100 × 15 mm-es Petri-csészékben. Jegyzet: In situ hibridizációhoz vagy vörös olaj-O festéshez 0,2 mM végkoncentrációjú 1-fenil-2-tiokarbamidot (PTU) adnak a pigmentképződés gátlásához, 1, de a hippokampusz elemzéséhez nem szükséges.
  2. Farmakológiai vizsgálatokhoz adjuk hozzá a szükséges vegyi anyagot a zebrafish embriók kifejlődéséhez megfelelő végső koncentrációban, kb. 26 órával a megtermékenyítés után (HPF), csak megfelelő vivőanyag-paranccsal. Jegyzet: könnyű farmakológiai inhibitorokra érzékeny, az elemzések során az embrióknak a sötét fronton lehet fejlődésük.

2. rész: Közvetlen anyagcsere profil a Hippocampus XF 24 analizátor segítségével

A tesztek végén kiszámítják a 10. és 10. nagyságrendű vegyileg kezelt embriók átlagértékeit.

3. rész: vörös olaj O színezék

  1. Az 50 LE/f sebességű embriókat finom csipesszel dekorionálják, és 4% PFA-ban rögzítik éjszakán át 4 ° C-on.
  2. Vörös olaj O-festést hajtunk végre, a 2. korábban leírtak szerint (lásd 4. ábra).

Reprezentatív eredmények

Szeretnénk megérteni a specifikus gének metabolizmusban betöltött szerepét, különös tekintettel a légzési sebességre és a lipid anyagcserére. Ezért a HPF típusú 26. hónapból származó vad zebrafish embriókat ezen gének egyike által kódolt enzim specifikus farmakológiai inhibitorával kezeltük. 50 hpf-nél a vivőanyaggal és az inhibitorral kezelt embriók felét elemeztük a Seahorse segítségével a mitokondriális funkcióhoz, míg a másik felét éjszakánként 4% PFA-ra állítottuk 4 ° C-on, majd olaj-vörös-O-val festettük a lipidek lerakódása érdekében. A specifikus enzimgátlóval végzett kezelés oda vezetett

Kétszer több bazális légzés (4A. ábra), amely fokozott lipidlerakódással járt, különösen a telencephalonban és az oticus vezikulum alatt (4B, C ábra).

pload/4300/4300fig1highres.jpg "/>1. ábra A zebrafish embriók kémiai kezelésének sematikus ábrázolása. Vad típusú, géntechnológiával módosított vagy farmakológiailag feldolgozott zebrafish embriók állnak a háttérben.

zebrafish
2. ábra: XF24 szigetlemez a helyén. (A) Négy üreg csak embrionális táptalajt tartalmaz hőmérséklet-szabályozásként (X-szel jelölve), a többi pedig egy embriót/üreget tartalmaz. (B) Közeli kép egy kútról (C6), amelyen egy 50 hpf vad típusú embrió látható, amelyet járművel (DMSO) kezeltek egy szigetecske (nyílhegy) képernyőkép.

3. ábra RespiratVad típusú ionparaméterek 50 HPF zebrafish embrióhoz. (A) Minden méréshez bemutatjuk a 20 egyedi embrió átlagát. Alaplégzés (átlag: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), maximális légzés (átlag: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), mentő légzési képesség (átlag: 87,7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) Minden méréshez 20 egyedi eredmény átlaga látható. Bazális mitokondriális légzés; mitokondriális légzés az ATP forgalma miatt; független mitokondriális légzés és nem mitokondriális légzés. Mt: mitokondriális; SRC: pótalkatrész Légzési kapacitás; SD: szórás, SEM: az átlag standard hibája. Az eredményeket pmol elfogyasztott O2/perc/embrió mennyiségben adjuk meg. Kattintson ide az ábra nagyításához .