Az apoptózis fehérje-2 sejtes inhibitorának expressziója humán szubkután és

  • absztrakt
  • bevezetés
  • Mód
  • Témák és mintavétel
  • RNS előállítás és RT-PCR
  • Fehérje izolálás és Western blot elemzés
  • Apoptózis detektálás
  • Statisztikai analízis
  • Eredmények
  • vita
  • hálaadás

absztrakt

CÉL: Ban,-ben ajándék Ebben a tanulmányban azzal a kérdéssel foglalkoztunk, hogy létezik-e depó-specifikus expressziója az apoptózis protein-2 celluláris inhibitorának (cIAP2) már gyermekkorban, és a relatív expresszió változik-e az életkor előrehaladtával a zsigeri elhízás kockázatának növekedésével.

Tárgyak: 23 beteg (12 gyermek és 11 felnőtt) kapott humán zsírszövet (OM) és szubkután zsírszövet (SC) párosított mintái.

MÓDSZER: A A cIAP2 mRNS-szinteket reverz transzkripciós polimeráz láncreakcióval (RT-PCR) határoztuk meg, és a fehérje expresszióját Western blot segítségével igazoltuk. Az apoptózis indexeket terminális dezoxinukleotidiltranszferáz által közvetített dUTP fluoreszcein nick-end jelöléssel (TUNEL) határoztuk meg.

EREDMÉNYEK : A cIAP2 mRNS 1,51-szer magasabb volt az OM-ben, mint az SC zsírszövetben (OM> SC 23 alany közül 20-ban; P SC 10 alany közül kilencben, P 1

Az elhízást a zsírszövet tömegének növekedése jellemzi. A testzsírtömeg, különösen a zsigeri zsír felhalmozódása szorosan összefügg az inzulinrezisztenciával, a szív- és érrendszeri betegségekkel, a magas vérnyomással és más súlyos anyagcserezavarokkal. 2 Ez megmutatta a genetikai tényezők azonosításának fontosságát, amelyek nemcsak a zsírtömeget, hanem a zsíreloszlást is szabályozzák.

Ismeretes, hogy az omentális (OM) és a szubkután adipociták (SC) különböző metabolikus tulajdonságokban különböznek egymástól, amelyek szabályozzák a zsírsejtek térfogatát. 3, 4 Úgy tűnik, hogy az emberi zsírsejtek replikációját, differenciálódását és apoptotikus válaszát az anatómiai régió befolyásolja. 5, 6. A zsírszövet eloszlása ​​tehát e folyamatok szabályozásának helyspecifikus eltéréseinek tulajdonítható. Nemrégiben bebizonyosodott, hogy a regionális jellemzők összefügghetnek a fontos funkcionális fehérjéket kódoló gének expressziójának helyspecifikus különbségeivel. Például a leptin és a PPAR γ expressziója magasabb az SC-ben, mint az OM zsírszövetben. 8, 9 Ezzel szemben az inzulinreceptor (11. példa) expressziója magasabb az OM-ben, mint az SC zsírszövetben. 9.

A celluláris apoptózis fehérje-2 inhibitor (cIAP2) az apoptózis fehérje családba (IAP) tartozik, amely részt vesz az apoptózis szabályozásában a sejtproliferáció és a differenciálódás során. 10., 11., 12. Az IAP-k szerepe az emberi zsírszövetben nem egyértelmű, de egyre több bizonyíték azt sugallja, hogy szerepet játszhatnak a testzsír-eloszlás szabályozásában a zsírsejtek apoptózisának modulálásával. Egy jelentés kimutatta, hogy a neuronális apoptózis gátló fehérje (NAIP) differenciálódástól függő expressziója a 3T3-L1 adipocitákban korrelálhat az adipocita apoptózissal szembeni rezisztenciájának kialakulásával. Két további tanulmány arról számolt be, hogy a cIAP2 mRNS depó-specifikusan expresszálódik a felnőtt emberi zsírsejtekben. 14, 15

Eddig a génexpresszió különbségeinek kutatása a felnőttekre összpontosított. Nagyon keveset tudunk a gyermekek zsírszövetében a helyspecifikus génexpresszióról. Mivel az emberi zsírszövet tömegében és megoszlásában életkorfüggő különbségek vannak, foglalkoztunk azzal a kérdéssel, hogy létezik-e már cIAP2 depó-specifikus expressziója már gyermekkorban, és ha igen, változik-e a relatív expresszió az életkor növekedésével, és fennáll-e a visceralis kockázat Elhízottság. A jelenlegi tanulmányban ezért összehasonlítottuk a cIAP2 expressziós szintjét mind az mRNS-nél, mind a fehérje szintjén gyermekek és felnőttek OM és SC zsírszövetében. Ezenkívül megvizsgáltuk a cIAP2 expresszió szintje, az adipocita apoptózis mértéke, a testtömeg-index (BMI) és a nem közötti kapcsolatot.

Mód

Témák és mintavétel

RNS előállítás és RT-PCR

A cIAP2 mRNS-szintjét minden olyan alanyban meghatároztuk, akiknél a teljes RNS mind az SC, mind az OM zsírszövetből rendelkezésre állt. A teljes RNS-t a TRIzol reagens (Invitrogen Life Technologies, CA, USA) felhasználásával állítottuk elő a gyártó protokollja szerint. Az RNS-t spektrofotometriásán kvantifikáltuk. Az RNS integritását a riboszomális RNS sávok etídium-bromid festésével ellenőriztük 1% agaróz gél alkalmazásával. A kapott RNS-t felhasználásig -70 ° C-on tároltuk.

RT-PCR-t végeztünk a cIAP2 mRNS elemzésére. A teljes RNS-t (0,5 × 1 μg) 1 órán át 42 ° C-on extraháltuk 20 μl pufferben, amely 200 U MMLV reverz transzkriptázt, 0,5 μg oligo d (T) 16, 0,5 mmol/l dNTP-t tartalmazott. 20 U RNáz inhibitor, reverz átírással. Kiegészítő DNS (cDNS) mintákat denaturáltunk 5 percig 95 ° C-on, és mindegyik mintából 5 μl cDNS-t használtunk a későbbi PCR-amplifikációhoz 50 μl puffer végső térfogatában, amely 2,5 U Taq DNS-polimerázt, 0 2 mmol/l dNTP-t, 2,5 mmol/l MgCl2-t és 0,4 μmol/l mindegyik primert tartalmazott. A PCR-körülmények 5 percig 95 ° C-os hőmérsékleten következtek, majd 30 ciklust folytattak 94 ° C-on 30 másodpercig, 60 ° C-on 45 másodpercig és 72 ° C-on 1 percig, végül 72 ° C-on további 10 percig. Az RT reagenseket a Promega Corp. szállította. (Madison, USA). A PCR reagensei Roche-ból (Mannheim, Németország) származnak. Ebben a szemikvantitatív RT-PCR-ben két primer készletet használtunk egyidejűleg (1. táblázat). Különböző számú PCR-ciklust alkalmaztunk annak biztosítására, hogy mind a cIAP2, mind a β-aktin cDNS amplifikációja az exponenciális tartományon belül legyen. A p-aktin primereit az egyes PCR-amplifikációk hatodik ciklusában adtuk hozzá.

Az amplifikációt követően 10 ul. A keverék 1 literét etídium-bromiddal festett 1,5% -os agarózgélen választjuk el. A géleket UV fényben tettük láthatóvá, a cIAP2 és a β-aktin sűrűségét, arányát megmértük és elemeztük a kvantifikációs szoftverrel, 4-es verziójú Windows és Macintosh (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) segítségével.

Fehérje izolálás és Western blot elemzés

Apoptózis detektálás

15 párosított mintában apoptotikus adipocitákat terminális dezoxinukleotidil-transzferáz-közvetített dUTP-fluoreszcein nick-end jelöléssel (TUNEL) detektáltunk a gyártó protokollja szerint. Apoptotikus indexeket úgy kaptunk, hogy 200 mikroszkóppal számoltunk legalább négy látómezőben fénymikroszkóp alatt.

Statisztikai analízis

Az adatokat a Társadalomtudományi Statisztikai Csomag (SPSS) segítségével elemeztük, és a 0,05-nél kisebb P-érték szignifikanciát adott. Mivel a cIAP2 expressziója normálisan nem oszlik el a zsírszövetben, a szövegben és a táblázatban mediánként (interkvartilis tartomány) jelenik meg. A SC és az OM közötti expressziós különbségek összehasonlítására a Wilcoxon által aláírt rangtesztet használtuk; A gyermekek és a felnőttek közötti depó-specifikus különbségek összehasonlítására Mann-Whitney-tesztet használtak. A korrelációkat a Spearman-korrelációs együttható teszt segítségével számoltuk ki.

Eredmények

Az SC és OM zsírszövetből származó cIAP2 mRNS-expresszió páros összehasonlítását RT-PCR-rel számszerűsítettük, az 1.a ábra szerint. Figyelemre méltó eltérés mutatkozott az egyének közötti expresszió szintjén, különösen az OM (1b) esetében. Ennek ellenére szignifikáns depó-specifikus különbség volt a cIAP2 mRNS expresszió szintjén (2. táblázat). A cIAP2 mRNS az OM-ben 1,51-szer magasabb volt, mint az SC zsírszövetben (23> 20-ból OM> SC; P.

fehérje-2

A cIAP2 mRNS-expressziójának depó-specifikus különbségei. (a) Példa agaróz gélanalízisre öt egyed SC és OM zsírszövetének párosított mintáinak RT-PCR után. (b) A szórási diagramok azt mutatják, hogy a cIAP2 mRNS expressziója minden egyén SC és OM zsírjában van. A vízszintes sávok jelzik a mediánt.

Western blotokat mutatunk be a 2. ábrán. Az mRNS expresszióval összhangban a cIAP2 fehérjetartalom magasabb volt OM-ben, mint SC-ben (10-ből kilenc alany közül OM> SC, P.

inhibitorának

A cIAP2 fehérje-expressziójának depó-specifikus különbségei. (a) Példa négy egyed SC és OM zsírszövetéből származó cIAP2 fehérjék immunblotjaira. (b) A scatterplots 10 egyed cIAP2 fehérje expresszióját mutatja SC és OM zsírban. A vízszintes sávok jelzik a mediánt.

Az immunhisztokémiai elemzés nem mutatott különbséget SC és OM között az adipociták apoptotikus indexeiben (14. apoptotikus indexek, amelyek a cIAP2 magasabb mRNS expresszióját mutatták OM-ben, mint a felnőttek SC adipocytái. Ugyanezek a szerzők azt is kimutatták, hogy a cIAP2 mRNS expressziója humán preadipocitákban az OM magasabb, mint az SC zsíré. 15 Vizsgálatuk azonban csak az mRNS szintjére összpontosított. Mivel az mRNS expresszió nem mindig tükrözi a fehérje expresszióját vagy a teljesen feldolgozott fehérje koncentrációját, a megfigyelést kibővítettük megerősítettük, hogy az OM és az SC zsírszövet közötti fő különbség a fehérje szintjén is előfordul.

A cIAP2-t eredetileg a TNF-a receptor jelátviteli komplexummal társított fehérjeként azonosították, ami arra utal, hogy részt vehet a TNF-a jelátvitel szabályozásában. 16 Az emberi cIAP2 fehérje túlzott expressziója elnyomhatja a különféle ingerek által kiváltott sejthalált. Humán izolált adipocitákhoz képest a szérumtartalmú táptalajban tenyésztett preadipociták magasabb cIAP2 mRNS-szinttel rendelkeznek, és alacsonyabb érzékenységet mutatnak a TNF-a által indukált apoptózisra is. 14., 15., 17. Ezért a cIAP2 expressziója SC és OM zsírszövetben tükrözheti a depó-specifikus hajlamot az apoptózisra, és ezáltal a zsírszövet elvesztését vagy lerakódását okozhatja.

Ebben a tanulmányban nem tudtunk kimutatni különbséget a bazális apoptózis arányában a két depóból származó adipociták között. Valószínű magyarázat az, hogy a bazális apoptotikus indexek túl alacsonyak voltak ahhoz, hogy pontosan számszerűsíteni és összehasonlítani lehessen őket. Ezt a nézetet támasztja alá az a tény, hogy Prins et al. A 17. ábra azt mutatta, hogy a szérumtartalmú táptalajban tenyésztett zsírsejtek bazális apoptotikus indexe az alkalmazott módszertől függetlenül nagyon alacsony volt. 6 Nem zárhatjuk ki azonban, hogy az alkalmazott módszer túl érzéketlen ahhoz, hogy kimutassuk a zsírszövet két helyének apoptózisindexében mutatkozó különbséget, amely korrelálhat a cIAP2 expressziójának különbségével. Ezenkívül a cIAP2 helyspecifikus expressziós különbségének fiziológiai szerepét a zsírszövetben még meg kell vizsgálni.

Összefoglalva, összehasonlítottuk a cIAP2 mRNS expresszióját SC és OM zsírszövetben 12 gyermeknél és 11 felnőttnél. Magasabb relatív expressziót találtak az OM-ben az SC zsírszövethez képest gyermekeknél és felnőtteknél. Ez arra utal, hogy a cIAP2 különböző expressziója a depók között a két depóból származó sejtek eredendő tulajdonságainak tudható be. A gyermekeknél kifejezettebb depó-specifikus különbség tükrözheti a zsigeri zsírszövet növekedésének növekedését.

hálaadás

Ezt a munkát a Jiangsu Oktatási Bizottság Tudományos Kutatási Alapja (99KJD 320012) és a Svéd Orvosi Kutatási Tanács (19X-05708) támogatta. Köszönjük Xu Xiaoqun úrnak, Lou Yao úrnak, Chen Yijiang úrnak és Peter Naredi professzornak, hogy zsírszövetmintákat szolgáltattak ezekhez a vizsgálatokhoz, és Tommy Olsson professzornak a gyümölcsöző beszélgetésekért.