Az epilepsziához kapcsolódó káliumcsatorna kaputöltési útja kémiai ligandumokat fogad el
- alanyok
- absztrakt
- bevezetés
- Eredmények
- A konzervált fenilalanin (F137) alapvető szerepe a ztz240 aktivitásában
- Kritikusabb maradékok azonosítása a KCNQ2-VSD-ben
- A ztz240 KCNQ2-VSD-hez való kötődésének szerkezeti modellje
- Új aktivátorok felfedezése a ztz240 kötőzsákhoz
- A kaputöltési utat megcélzó aktivátorok epilepsziaellenes aktivitása
- vita
- További információ
- PDF fájlok
- Kiegészítő információk, S1. Ábra
- Kiegészítő információk, S2. Ábra
- Kiegészítő információk, S3. Ábra
- Kiegészítő információk, S4. Ábra
- További információk, S5. Ábra
- Kiegészítő információk, S6. Ábra
- Kiegészítő információk, S1 táblázat
- Kiegészítő információk, S2 táblázat
- Videók
- További információk, S1 film
Videó: Jeep Wrangler Hitch Mounted Cargo Rack XL (1987-2016 YJ, TJ & JK) Review & Install (2020 november).
alanyok
absztrakt
bevezetés
Eredmények
A konzervált fenilalanin (F137) alapvető szerepe a ztz240 aktivitásában
Kritikusabb maradékok azonosítása a KCNQ2-VSD-ben
Az F137 a KCNQ2 VSD S2 szegmensének közepén található. További mutánsokat terveztünk a VSD-t szegélyező maradványok számára. A funkcionális mutációk közül az E130A, az I134A, a G138A, az R207W és az R210A drámai módon csökkentette a ztz240 potenciáló hatását mindhárom fő szempontból. Csökkentették az áram amplitúdóarányának növekedését a külső felé (I/I 0), és megakadályozták vagy gyengítették a GV görbe bal oldali eltolódását (ΔV 1/2) és a deaktiválás lelassulását (2. ábra). Ezeknek a mutánsoknak szinte átfedő farokáramai ztz240-vel és anélkül egyértelműen mutatják a dezaktiválódás csökkent hatásait (további információk, S1. Táblázat). Ezzel szemben az S105A és M174A mutációk csillapították a GV görbe bal eltolódását, de nem csökkentették az I/I 0 arányt, és nem akadályozták meg a deaktiválás lelassulását (2. ábra és további információk, S1. Táblázat). Több esszenciális maradék azonosítása tovább mutatja a VSD jelentőségét a ztz240 aktivitás szempontjából.
A ztz240 aktivitás szempontjából kritikusabb maradványok azonosítása a KCNQ2-VSD-ben. (A) Azonosított kritikus mutánsok reprezentatív nyomai 10 μM ztz240-vel és anélkül. (B) 10 μM ztz240 hatása a VSD mutánsok külső áramamplitúdójára (n> 3). Minden mutációs helyet a megjósolt transzmembrán régiók alapján jelezünk. A szaggatott vonal 10 μM ztz240 potenciós szintet jelez a vad típusú KCNQ2 csatornán. A tesztpotenciál +50 mV. (C) 10 μM ztz240 hatása a VSD mutánsok V 1/2-ére (n> 3). A V 1/2 jelzi a V 1/2 változását a ztz240 alkalmazása után. ΔV1/2 = V1/2 ztz240 jelenlétében - V1/2 a kontrollban.
A ztz240 KCNQ2-VSD-hez való kötődésének szerkezeti modellje
Mivel a KCNQ2 és más ligandumokkal alkotott komplexeinek kísérleti struktúráját nem határozták meg, nehéz strukturális modellt felépíteni a ztz240-KCNQ2 kölcsönhatásra. Ennek megfelelően hierarchikus stratégiát alkalmaztak a strukturális modell felépítéséhez a homológiai modellezés, a molekuláris dokkolás és az MD szimuláció kiterjedt alkalmazásával, a mutagenezissel és az elektrofiziológiai meghatározásokkal együtt. A mutagenezis eredménye arra utal, hogy a ztz240 potenciális kötő zsebe a VSD-ben helyezkedik el, nem pedig más doménekben (1. ábra). További elektrofiziológiai kísérletek azt mutatják, hogy a ztz240 nyitott állapotban kötődik a VSD-hez (további információk, S3. Ábra). Ezért először létrehoztunk egy háromdimenziós (3D) modellt a KCNQ2 transzmembrán doménjéhez a nyílt Kv1.2 29., 30., 31. csatorna strukturális információi alapján, a Discovery Studio 2.6-tal (további információk, S1B ábra).
A ztz240 kötésmodell VSD-vel. (A, B) Tábornok (A) és részletes (B) A ztz240 és a VSD interakcióinak nézetei. A ztz240 és a maradékok golyóként és botokként vannak feltüntetve. A ztz240 szén-, oxigén-, nitrogén-, klór-, fluor- és hidrogénatomjai világoskék, piros, sötétkék, zöld, narancssárga és fehér színűek. Az áttekinthetőség érdekében csak néhány kulcsfontosságú hidrogénatomot mutatunk be. A hidrogénkötéseket vagy az elektrosztatikus kölcsönhatásokat piros vonalak jelzik. A CH-π kölcsönhatást és a halogénkötést fekete, illetve zöld vonalak jelzik. (C) A ligand-VSD komplexek szerkezeti modelljeiből kivont kötőzsák szerkezete. Az érthetőség érdekében a ligandumokat eltávolítottuk. A táska felülete sárga színnel látható. A jobb oldalon a táska három keresztmetszete látható kívülről. A maradványokat pálcikaként mutatják be. Az "Out" és az "In" a sejtmembrán külső és belső oldalát jelöli.
A kötési zsebet bélelő kritikus maradványok többsége S2 és S4, például E130, I134, F137, G138, R207 és R210, míg az S1 és S3 nagyon kevés maradványa befolyásolja a kapcsolatot, például S105 és M174 (ábra 3)), amelyek nem konzerválódnak a KCNQ izoformákban. Az S1 és S3 külső szegmenseiben a ztz240 aktiválásában szerepet játszó maradványok további értékeléséhez a fennmaradó maradékokat - a 2B és 2C listában felsoroltak kivételével - alanin-pásztázással vizsgáltuk, és egyik sem befolyásolta jelentősen a ztz240 aktivitását ( További információk, S1) táblázat). Ezek a további mutációk és elektrofiziológiai meghatározások retrospektíven igazolják ismét a ztz240-KCNQ2 kötési modellünket.
A ztz240-KCNQ2 kölcsönhatás modellje világosan leírja a VSD széles zsebét, amely a VSD extracelluláris szájától az R210-ig terjed (3C ábra). Ez a lehetséges ztz240 kötő zseb a KCNQ2-ben részben átfedésben van a Shaker és a Kv1.2-2.1 kiméra csatornák kaputöltési útvonalainak megfelelő területeivel, bár kiterjedtebb és mélyebb (1A és 3C) 5, 6, 7, 8 9, 10, 11, 12, 14, 15. Ez a megállapítás összhangban áll a korábbi tanulmányokkal, amelyek arra utalnak, hogy a Kv-csatornák VSD-je gyógyszeres kezelésre alkalmas hely lehet 19, 20. Vizsgálatunk azt is megállapította, hogy a KCNQ2 kaputöltési útja új funkcióval rendelkezhet, amely közvetlen kötő zsebként működik a meglévő és újonnan kifejlesztett aktivátorok, például a ztz240 és az ebben a tanulmányban felfedezett új vegyületek számára (lásd alább).
Új aktivátorok felfedezése a ztz240 kötőzsákhoz
A struktúra-alapú virtuális szűrés azonosítja a különböző kemotípusú aktivátorokat. (A) A külső áram amplitúdójának növekedése a vegyület jelenlétében, amint azt jeleztük. A tesztpotenciál -10 mV. A szaggatott vonal 1-es hatványozási szintet mutat (azaz nincs hatványozás). (B) YG002, YG025 és YG027 dózis-válasz görbéi (n> 3 minden adatpontnál). (C) A felfedezett aktivátorok kémiai szerkezete. A VSD intracelluláris vége felé orientált töredékeket narancssárga színnel emelik ki. (D) A VSD-vel kilenc azonosított aktivátor egymásra helyezett kötési modelljeinek általános nézete.
A kaputöltési utat megcélzó aktivátorok epilepsziaellenes aktivitása
Elsődleges anti-epilepszia szűrővizsgálatot végeztünk ezen vegyületek aktivitásának értékelésére egerekben, a Maximum Electroshock (MES) által kiváltott roham modell segítségével. A tesztelt aktivátorok közül a ztz240, YG007 és YG018 védettségi aránya> 50% volt, ezért további vizsgálatra választották őket MES által indukált és pentilenetetrazol (PTZ) által indukált roham modellekben (további információk, S2. Táblázat). A retigabint pozitív kontrollként abbahagyták. Mindhárom vegyület kiváló antiepilepszia-aktivitást mutatott mindkét modellben. A MES által kiváltott rohammodellben a három vegyület egyszeri adagolása jelentősen megakadályozta a tonikus hátsó lábak megnyúlását. A védettségi arány (100%, 90% és 90%) összehasonlítható a retigabinéval (1. táblázat). A PTZ által kiváltott rohammodellben a három vegyület a retigabinéval összehasonlítható epilepsziaellenes aktivitást mutatott. Ezen vegyületek egyetlen dózisa nemcsak jelentősen késleltette a klón késleltetését, hanem csökkentette a generalizált tonikus-klónikus roham (GTCS) és a mortalitás előfordulását is (2. táblázat).
vita
A KCNQ2 csatorna kaputöltési útja kémiai ligandumokat fogad el. (A) Részletek arról, hogy az aktivátorok hogyan érintkeznek és befolyásolják az R207-et és az R210-et nyitva, a ztz240 és az YG002 példáján keresztül. Az aktivátorok kitöltik az R207 és R210 közötti teret. A szaggatott vonalak jelzik az aktivátorok és az R210 közötti kölcsönhatásokat. (B) A rajz bemutatja, hogy egy vegyi ligand hogyan hat a kapu töltési útjára azáltal, hogy a kapu töltési útjában van, és megakadályozza, hogy az arginin lefelé mozduljon.