Az erek védelme az érelmeszesedés ellen - Az által kiválasztott miRNS-ek szerepe
Karine Tréguer 1, 2 *, Susanne Heydt 1 és Eduard Hergenreider 1
1 Molekuláris Orvostudományi Centrum, Kardiovaszkuláris Regenerációs Intézet, Frankfurti Egyetem Orvostudományi Egyetem, 60590 Frankfurt am Main, Németország
2 Jelenlegi cím: UMR CNRS 5164, University Bordeaux 2, 146, rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux, Franciaország
Az áramlás hatása az atheromatous plakk kialakulásában. Felső keret: A lamináris áramlás indukálja a KLF2 expresszióját az endothel sejtekben (EC). A KLF2 felelős a mögöttes simaizomsejtek (SMC-k) kontraktilis és atheroprotektív fenotípusának fenntartásáért. Alsó keret: Amikor az áramlás turbulens, egy ateroszklerotikus bifurkáció vagy plakk körül, a KLF2 expressziója EC-kben csökken, és az alapul szolgáló SMC-k pro-ateroszklerotikus proliferatív fenotípust feltételeznek. Az üzemtanácsok és a CML-ek KLF2-n keresztüli kommunikációja a tanulmány tárgya.
MiRNS-ek: a génexpresszió-szabályozás új szintje
A CE és a CML közötti kommunikáció választott közvetítői a mikroRNS-ek (miRNS-ek). A MiRNS-ek kicsi, egyszálú, nem kódoló RNS-ek (22 nukleotid), amelyeket átírnak a sejtmagban, hasítanak - nevezetesen a Drosha és Dicer enzimek révén - és beépülnek egy elhallgattatás ami a cél mRNS transzláció gátlásához vagy lebomlásához vezet [7, 17]. Ezek a molekulák már ismertek a vaszkularizációban, valamint a különböző vaszkuláris patológiákban betöltött fontos szerepükről [8]. Célunk az volt, hogy meghatározzuk, hogy a KLF2 képes-e szabályozni a miRNS expresszióját az EC-kben és hozzájárulhat-e ezekhez a vaszkuloprotektív hatásokhoz.
Nyíróerők szabályozzák a miRNS expresszióját az EC-kben keresztül KLF2
Először meghatároztuk a miRNS-eket, amelyeket a KLF2 és az EC-k nyíróerői szabályoznak. Ez a kettős elemzés lehetővé tette a KLF2 új célpontok azonosítását az áramlásra reagálva: a fürt miR-143/145. Ezeket a miRNS jelölteket a KLF2 érvénytelenítésével validáltuk in vitro, és megmutattuk, hogy KLF2 hiányában ez fürt már nem indukálják nyíróerők. Ezenkívül a KLF2 képes kötődni ennek a promoteréhez fürt és előidézi annak kifejezését. A nyíróerők ezért indukálják a KLF2 expresszióját CE-ben, ez pedig a miR-143/145 expresszióját. Ez fürt korábban az SMC-kre kifejtett atheroprotective hatásáról volt ismert [9].
miRNS és sejtközi kommunikáció: CE és CML között
Arra kerestük a választ, hogy a KLF2 képes-e parakrin módon ellenőrizni az SMC-ket keresztül miR-143/145. A legújabb tanulmányok kimutatták az extracelluláris miRNS jelenlétét a test különböző folyadékaiban [10], keringő miRNS-eket, amelyek valódi biológiai nyomjelzőket jelentenek különböző patológiákban, például rákban [11, 18] vagy szív- és érrendszeri betegségekben [12]. A keringő miRNS-ek biológiai funkciója még nem teljesen ismert, de úgy tűnik, hogy szerepet játszhatnak a sejtek közötti kommunikációban [13].
A vér számos ribonukleázot tartalmaz, és a keringő miRNS-eket úgy gondolják, hogy fehérjék megkötésével vagy vezikulákba történő beépítésükkel védik a lebomlástól [15, 16], utóbbi mechanizmust előnyben részesítve. (2A. Ábra).
Az intercelluláris kommunikáció elemzése. NÁL NÉL. Az extracelluláris miRNS-ek védelmének biokémiai elemzése. A mintát proteináz K-val vagy detergenssel kezeljük a fehérjék vagy a lipidmembránok lebontására, majd az RNS-eket RNáz-kezeléssel lebontják. Ha lebomlanak, ez azt jelzi, hogy hozzáférhetőek voltak, és feltárja a védelem, a fehérje vagy a membrán típusát. B. Közös kultúrarendszer az EC-k és az SMC-k közötti anyagátadás tanulmányozására. PBS: foszfátpuffer sóoldat.
Elemeztük a CE felülúszót, amely túlzottan expresszálja a KLF2-t, vagy nyírófeszültségnek van kitéve. Fejezetben leírt technikát alkalmazva 2. ábra, be tudtuk mutatni, hogy ezek a miRNS-ek az extracelluláris táptalajban vannak és vezikulában védettek (2A. Ábra). Különböző típusú vezikulákat azonosítottak és osztályoztak méretük és kialakulásuk mechanizmusa szerint. A mélyreható elemzések (különösen elektronmikroszkóppal) lehetővé tették számunkra annak megállapítását, hogy a miR-143/145-t tartalmazó vezikulák mikrovezikuláris és/vagy exoszómás (MV) típusúak-e.
Annak igazolására, hogy az SMC-k valóban képesek-e felhasználni az EC által kibocsátott vezikulák tartalmát, együtt tenyésztettünk eGFP-t expresszáló endothelsejtek között (zöld fluoreszcens fehérje) vagy miRNS-sel transzfektálva C. elegans (cel-miR-39) és az alapul szolgáló SMC-k (2B. Ábra). Az SMC-k immunfluoreszcencia-analízise az eGFP jelenlétét mutatta, az RT-qPCR elemzés pedig az eGFP-t kódoló mRNS-ek jelenlétét mutatta ki, bizonyítva, hogy az EC-k továbbították az mRNS vezikuláit az SMC-khez. RT-qPCR analízissel a cel-miR-39 jelenlétét is képesek voltunk kimutatni MV-kben; ezeket továbbítják a cel-miR-39 által transzfektált CE-vel együtt tenyésztett SMC-kbe is. Az EC transzport mRNS-ek és miRNS-ek által termelt és SMC-k által beépíthető MV-k.
Az endoteliális MV-kben található MiRNS-ek ateroprotektív hatással vannak az SMC-kre
A miR-143/145 expresszióját a két sejttípus fejezte ki. Ezután arra törekedtünk, hogy ellenőrizzük, hogy ezeknek a miRNS-eknek az EC-k hozzájárulása befolyásolja-e az SMC-k fenotípusát. Ezért gátoltuk a miRNS endogén termelését SMC-kben a Drosha (CML KO) gátlásával. Amikor ezeket az SMK-ket, amelyek nem expresszálják az endogén miRNS-eket, a KLF2 túlexpresszáló CE jelenlétében növesztjük, a miR-143/145 növekedését észleljük. Ez azt jelzi, hogy az miR-143/145-t az EC-ből az SMC-be szállították. Megmutattuk, hogy ezek a KO SMC-k által elfogott miRNS-ek a pro-ateroszklerotikus célpontok, például az ELK1 csökkenéséhez vezetnek (E huszonhat, mint az I. transzkripciós faktor), A KLF4 és az SSH2 (csúzli-I fehérje foszfatáz); az SMC-kbe továbbított miR-143/145 endoteliális miRNS-ek ezért felelősek az SMC-kben megfigyelt atheroprotektív hatásokért (3. ábra).