Az indukálható hem-oxigenáz (HO-1) hatása a mikrocirkulációra a
1 Az Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Sebészeti Egyetem Klinikájának Általános és Visceralis Sebészeti Osztályáról. Az indukálható hemoxigenáz (HO-1) hatása a mikrokeringésre poszt-ischaemiás pancreatitisben I N A U G U R A L - D I S S R R A T I O N az Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. 2006-ban mutatta be Moritz Scholtes, aki Aachenben született
2 2 Dékán: Prof. Dr. med. C. Peters 1. bíráló: PD Dr. med. O. Thomusch 2. bíráló: Prof. Dr. med. B. Bontások A diploma megszerzésének éve: 2007
4 4 Ezt a munkát dr. med. E. von Dobschütz
5 5 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS AKUT PANCREATITIS MIKROCIRKULÁCIÓ ISCHEMIA REPERFUSION HEMDEGRADATION HEMOXYGENASE MEGHATÁROZÁSÁBAN Anesztézia és szellőztetés Mikrosebészeti technológia vizsgálati módszerek Macrohemodynamics Microhemodynamics Funkcionális kapilláris sűrűségű Leukocyte-endotél kölcsönhatás Laboratóriumi paraméterek meghatározása HO aktivitás kimutatására Northern blot analízis Western blot analízis Kísérleti protokoll Vizsgálati csoportok Vizsgálati eljárás Szabályozott feltételek Activity ischaemia-repaemitis-hemogenase-gátlás-oxigenizáció-gátló hatást az ischaemia-repemeritis-hemogenase-gátló-oxigenáz-aktivitás gátlásának aktivitásának ischaemia-rE-creatitis-hemogenase-STA-oxigenáz-oxigénellátás a pankreász aktivitással. 35
6 6 4. EREDMÉNYEK MAKROHAEMODINAMIKA MIKROHAEMODINAMIKA Funkcionális kapilláris sűrűség Leukocita-endothel interakció LABORATÓRIUMI PARAMÉTEREK HEMOXYGENASE DETECTION Aktivitás detektálás Northern blot Western blot EREDMÉNYEK Ischaemia és reperfúzió hatása Makrohemodinamika Mikrohemodinamika Leukocita-endotheliális kölcsönhatás Haemoxigenáz expresszió és aktivitás HO HO makrohemodinamika Mikrohemodinamika Leukocyta-endotheliális interakció Haemoxigenase expresszió és aktivitás A LISTÁBAN VEZETŐ ÖSSZEFOGLALÓ. 98
10 10 Ezek a mechanizmusok mikrocirkulációs rendellenességet eredményeznek, ami viszont a szövetek energiaellátásának csökkenéséhez vezet, és így fenntartja az ördögi kört (1. ábra). Na + -K + - ATPáz Na + -Ca 2+ - Antiport ATP Na + Ca 2+ proteázok XDh O 2 Hyx + XOx Ischaemia Blood-O 2 Reperfúzió O 2 -Radikális permeabilitás Ödéma Trombózis Leukocita alvadás Sejtkárosodás Endothelialis károsodás Enzimek citokinek 1. ábra: Az ischaemia-reperfúziós károsodás ördögi köre: Az ischaemia (fent) folyamatai károsítják a reperfúziós sejteket (az alábbiakban), ami a szövet további hipoxiás károsodásához vezet
17 17 2. A VIZSGÁLAT CÉLJA Jelen kísérleti vizsgálat célja egy órás ischaemia és két órás reperfúzió hatásának vizsgálata volt a hasnyálmirigy mikrocirkulációjára. Megvizsgálták, hogy a körülmények változnak-e az idők folyamán. Továbbá meg kell határozni, hogy az indukálható ha-oxigenáz (HO-1) exogén indukciója befolyásolja-e ezeket a körülményeket. Különösen a funkcionális kapilláris sűrűséget, mint a táplálkozási ellátás helyzetének paraméterét reperfúzióban, valamint a leukocita-endothel interakciót vizsgálták, mint a korai gyulladásos reakció paraméterét. Ezen paraméterek meghatározásához intravitális epifluoreszcens mikroszkópia módszerét használtuk. A hem-oxigenáz expressziójában és aktivitásában kifejtett hatását molekuláris biológia igazolta. A munka a következő szakaszokra tagolódik: 1. Az ischaemia és a reperfúzió hatása a hasnyálmirigy mikrocirkulációjára anélkül, hogy exogén hatással lenne a ha-oxigenázra.
22 22 5. ábra: A hasnyálmirigy-artériák edényeinek sematikus lefutása (HOFFMANN 70-től)
24 24 Japán), és a dátum és az idő megjelenik és rögzítésre kerül a monitor képernyőn (WV-BM 1700, 41 cm-es átló, Panasonic, München). A fent említett nagyító eszközök (mikroszkóp, CCD kamera, monitor) használatával kb. 680x teljes nagyítást sikerült elérni. CCD ZG SVHS IVM TV 6. ábra: intravitális mikroszkópos kísérleti beállítás: Patkány hasnyálmirigy-csatlakozással a léphez az epifluoreszcens mikroszkóp alatt (IVM: intravitális mikroszkóp, CCD: töltéssel összekapcsolt készülékű kamera, ZG: időzítő, SVHS: videofelvevő, TV: monitor) működőképes Kapilláris sűrűség A funkcionális kapilláris sűrűség a vörösvérsejtekkel perfundált kapillárisok hossza [cm] a megfigyelési terület területéhez viszonyítva [cm²]. Azok a kapillárisok, amelyeket nem perfundáltak vagy csak plazmával perfundáltak, nem tartoznak az értékelésbe. A plazma vizualizálása céljából 0,15 ml fluoreszcein izotiocianáttal jelzett szarvasmarha-albumint (FITC-albumin, A-9771, 0,75%, Sigma-Aldrich Co, Deisenhofen, Németország) injektáltunk intravénásán. A fényforrás általi gerjesztés után a fluorokróm-fluoreszcein-izotiocianát nm hullámhosszú fényt bocsát ki, amely az upstream szűrőn keresztül kontrasztos képet alkot a mikrocirkulációról.