Az MT7 toxikus muszkarin receptor komplex modellezése termodinamikai adatok alapján -
Az MT7 muszkarin/toxikus receptor komplex modellezése termodinamikai adatokból Guillaume Letellier Ezt a változatot idézve: Guillaume Letellier. Az MT7 muszkarin/toxikus receptor komplex modellezése termodinamikai adatokból. Élettudományok [q-bio]. Paris-Diderot University - Párizs VII, 2008. francia. tel-00447060 HAL Id: tel-00447060 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00447060 Beküldve 2010. január 14-én. A HAL egy multidiszciplináris nyílt hozzáférésű archívum tudományos kutatási dokumentumok letétbe helyezéséhez és terjesztéséhez, függetlenül attól, hogy vannak-e megjelennek vagy sem. A dokumentumok származhatnak francia vagy külföldi oktatási és kutatóintézetekből, vagy állami vagy magán kutatóközpontokból. A HAL multidiszciplináris nyitott archívum kutatási szintű tudományos dokumentumok letétbe helyezésére és terjesztésére szolgál, akár publikálva, akár nem, francia vagy külföldi oktatási és kutatóintézetekből, állami vagy magán laboratóriumokból.
Inter doktori iskola /// A muszkarinreceptor-komplex/MT7 toxin biomodellezése termodinamikai adatokból Bemutatták és nyilvánosan támogatták 2008. október 8-án. A Denis Diderot Egyetem doktori fokozatának megszerzéséhez a genomelemzés és a molekuláris modellezés terén GUILLAUME LETELLIER a zsűri: Szakdolgozat-igazgató: Dr. Bernard GILQUIN Előadók: Vizsgáztatók: Dr. Michael NILGES Dr. Serge CROUZY Prof. Catherine ETCHEBEST, elnök Prof. Marc LE MAIRE Dr. Denis SERVENT CEA/iBiTec-S/SB2SM/LBSR CEA Saclay, 91191 Gif sur Yvette
1. fejezet: Rövidítések AR adrenerg receptor Ach acetilkolin DNS dezoxiribonukleinsav AFM atomi erő mikroszkópia AMPc ciklikus adenozin monofoszfát TCM háromkomplexus modell CHO kínai hörcsög petefészek DAG Diacilglicerin egfp Enhanced green fluorescent energy transfer protein FRET Fluorescent Dougain Fluorescent Gine-fluorescine Gine-fluorescine Gine-fluorescine Gine-fluorescine Gine-fluorescine Gine-fluorescine Gine-fluorescine Gine-fluorescine Gine-diocine Gine-fluorescine Gine-fluorescine Gine-fluorescine Gine-fluorescine Gine-fluorescine Gine-fluorescine Gine-fluoroscine Gine-fluoroszin-triozin vagy FTon -foszfát HADDOCK Nagy kétértelműséggel vezérelt biomolekuláris dokkoló hm1 Humán muszkarin receptor 1. altípus hm3 Humán muszkarin receptor 3. altípus IP3 Inozitol-tri-trifoszfát M moláris (mol.l -1) machr Acetilkolin muskarinreceptora MT Muskarin-toxin nm nanomól-NMS N-metilszkopol nanoszekundum PDB Protein data bank PKA Protein kinase A PKC Protein kinase C PLC C típusú foszfolipáz pm pm pikomolar RCPG Protein kapcsolt receptor G RMN Nukleáris mágneses rezonancia RMSD Átlagos másodfokú érdeklődési terület SDS-S ódium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-gél elektroforézis TCM modell a terner komplex TM transzmembrán doménjéhez 4
1. fejezet: Bevezetés 5.1.2. Figyelembe nem vett adatok 147 5.1.2.1. W91 M1/Y30 tox 147 R52 tox/W400 M1 149 5.2. A muszkarinreceptorok dimerizálása 150 5.2.1. Az interakciós felület jellege 150 5.2.2. A receptor dimer összeszerelési módja 151 5.2.3. Magasabb rendű oligomerek 154 5.3. A toxin farmakológiai tulajdonságainak molekuláris alapja 156 5.3.1. Linkoldal 156 5.3.2. Sztöchiometria NMS/MT7/hm1 156 5.3.2.1. 1. hipotézis: 1 dimer M1, 1 toxin, 1 NMS 156 5.3.2.2. 2. hipotézis: 1 dimer M1, 2 toxin, 2 NMS 157 5.3.3. Nagy kötési affinitás 158 5.3.4. Szelektivitás az M1 muszkarinreceptortípus 161 számára 6. fejezet: Következtetések és perspektívák 164 6.1. Távlatok: az alloszteria molekuláris alapjai 166 7. fejezet: Ábraindex 171 8. fejezet: Irodalomjegyzék 175 9. fejezet: Függelékek 190 9.1.1. Az RCPG 191 ortoszterikus ligandumai 9.1.2. A hm1 és a rodopszin szekvenciák igazítása 192 9.1.3. Rakományszimuláció 193 9.1.4. Aktivált molekuladinamikai szimuláció 196 9.1.5. A membrán molekuladinamikájának szimulációi 198 9.1.6. A TERA10 200 8 gép molekuláris dinamikai kódjainak benchmarkja
1. fejezet Bevezetés
1. fejezet: Bevezetés 4. ábra: A szarvasmarha-rodopsin szerkezete Az extracelluláris domén lilával, az E2 hurok pedig piros színnel látható. A PDB 1U19 koordinátái alapján (Okada, Sugihara et al. 2004). 17.
1. fejezet: Bevezetés 1.4.1. A muszkarin receptorok altípusai Az emberi genom szekvenálását követően úgy tűnt, hogy az embereknél a muszkarin receptoroknak számos altípusa van, nagyon nagy szekvencia-hasonlósággal (11. ábra). Jelenleg az embernél 5 muszkarin receptor altípus ismert. Míg a páros számokat (1, 3, 5) előnyösen az inozitol-trifoszfát útvonalhoz kapcsolják, a páratlan számokat a ciklusos erősítő útvonalhoz kapcsolják. A muszkarin receptorok lokalizációját alaposan tanulmányozták (Abrams, Andersson et al. 2006). Számos szervre elosztják, mint például a hólyag, a belek, a nyálmirigyek, a szív, a szem stb. Különös figyelmet fordítottak az agyban való eloszlásukra (Volpicelli és Levey 2004), ahol többek között szerepet játszanak az idegsejtek ingerelhetőségében, a szinaptikus plaszticitásban, valamint az acetilkolin visszacsatolási mechanizmusaiban. Az 5 receptor az agy különböző régióiban expresszálódik. Az M1, M4 és M5 altípusok például a központi idegrendszer szintjén lokalizálódnak, míg a hm2, 3 altípusok a perifériás idegrendszer szintjén vannak jelen. 30
1. fejezet: Bevezetés 11. ábra: Az 5 muszkarin receptor altípus szekvencia igazítása A transzmembrán hélixeket zöld sávok jelzik 31
1. fejezet: Bevezetés rhodopsin: a retina megkötőürege, ez az üreg a hélix köteg mélyén helyezkedik el. (A) 13. ábra: A hm1 receptor ortoszterikus kötőhelyének modellje. A) az endogén ligandum, az acetilkolin (bíborvörös). B) ortoszterikus antagonista, N-metilkopolamin (bíborvörös) Goodwin szerint (Goodwin, Hulme és mtsai 2007) (B) 34
1. fejezet: Bevezetés 14. ábra: Az orto- és alloszterikus ligandumok kötése a muszkarin M2 receptorhoz A két ligandum sárga színű, a muszkarin M2 receptor Y177 és W422 maradéka piros színű. Jager szerint (Jager, Schmalenbach et al. 2007) 36
1. fejezet: Bevezetés 1.5.2. Szerkezet A muszkarin toxinok egy 65-66 aminosavból álló peptidcsalád (16. ábra), 4 diszulfid kötéssel. Jelenleg összesen egy tucat ismert, de nem mindegyiket szekvenálták. Az MT2 muszkarin toxin (31. ábra) szerkezetét NMR-vizsgálattal (Segalas, Roumestand és mtsai 1995), majd kristályosítással és röntgendiffrakcióval oldottuk meg 1,50 Å felbontással (PDB kód: 1FF4). Ez a szerkezet három ujjhajtást mutat, amely öt antiparallel párhuzamos p-szálba szerveződik, amelyeket három hurok (I, II és III) köt össze. A fehérje magját négy diszulfid híd stabilizálja. Ez a szerkezeti motívum sok kígyó-toxin családban (Galat, Gross és mtsai. 2008), például α-neurotoxinokban (Popot és Changeux 1984), fasciculinokban (Du, Marchot és mtsai 1992) vagy kardiotoxinokban gyakori. 16. ábra: A muszkarin toxin szekvenciák illesztése A 4 diszulfid hidat a szekvenciák mutatják be 17. ábra: Az MT2 toxin kristálytani szerkezete (PDB kód: 1FF4) 38
1. fejezet: Bevezetés 19. ábra: A II toxin hurok és az E2 receptor hurok szekvenciaillesztése Zavaró szekvencia hasonlóságot tapasztalhatunk a II toxin hurok és az E2 receptor hurok között (19. ábra), ami arra utalhat, hogy a toxin kiszoríthatja a receptor hurokot és felveheti hely. 40
1. fejezet: Nehéz bevezetés, de reálisabb a biológia problémái szempontjából, mint az elején összekapcsolt/összekapcsolt problémák. A modell értékelési kritériumai a következők: F nat: a megjósolt natív kontaktusok aránya/a natív L_rms: RMSD komplex aránya a ligandum gerincének atomjain az előre jelzett és natív I_rms: RMSD receptorok egymásra helyezésével. maradványok a modell és a natív komplex közötti határfelületen Ahhoz, hogy referenciát kapjunk az RMSD szempontjából, Chotia és mtsai (C. Chothia 1986) megállapították, hogy ugyanazon fehérje kristálytani szerkezetének átlagosan két független meghatározása átlagosan 0,5 AT eltérést eredményez. Ami az NMR-rel meghatározott struktúrákat illeti, a modellek közötti különbségek értéke meghaladhatja az 1,5 Å értéket. 46