Az orvosi egyetemi klinikáról
1 A Freiburgi Albert Ludwig Egyetem Orvostudományi Egyetemi Klinikai Belgyógyászati Osztályától i. Br. A TRAF2 és a TRAF6 szerepe az érelmeszesedésben I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N az Albert-Ludwigs-Universität Freiburg orvosi karának orvosdiplomájának megszerzéséhez i. Br. 2010-ben Peter Stachon Göppingenben született
2 dékán: Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert Erich Blum 1. bíráló: PD Dr. Andreas Zirlik 2. bíráló: PD Dr. Michael Hoffmann PhD éve: 2011
4 Tartalom-jegyzék TRAF2 és TRAF6 atherosclerosisban Egerek genotipizálása: DNS-izolálás Egerek genotipizálása: Polimeráz láncreakció (PCR) Magzati májsejt-transzplantáció egerekben Magzati májsejt-transzplantáció folyamata Donor őssejtek generálása Donorok genotipizálása: Qiagen-kit Myeloablative irradiation of recipiens és transzplantáció Magzati máj őssejt-transzplantáció CD45.1 egerekben Táplálkozási vizsgálat Retroorbitalis vérvétel diéta előtt Nagy dózisú koleszterin diéta Az ateroszklerózis értékelése Az egerek előkészítése 18 hetes nagy dózisú koleszterin diéta után Készítmények gyártása hasi aortához Szövettani készítmények gyártása Színező olaj-vörös- Festés az artériás fal zsírtartalmának megfestésére Immunohistokémiai MAC-3 festés az artériás fal makrofágjaihoz CD4 + T helper sejtek immunhisztokémiai festése K K immunohisztokémiai simaizomsejt festése Kollagén: Picrosirius Red festés értékelése A metszetek fényképezése Az aorta gyökér értékelése Az aorta boltívek és a hasi aorta értékelése. 42
8 Bevezetés A TRAF2 és a TRAF6 az érelmeszesedésben 1. ábra: Európában a szív- és érrendszeri betegségek a leggyakoribb halálokok A szív- és érrendszeri férfiak (fent) és a nők (alatt) a leggyakoribb halálokok. E betegségek többsége patofiziológiailag az érelmeszesedésen alapul. Forrás:
52 A TRAF2 és TRAF6 eredményei atherosclerosisban Négy hetes rekonstitúciós fázis után vért vettünk az egerekből, és FACS segítségével értékeltük a CD45.1 helyreállítását CD45.1-APC-vel és CD45.2-PE-vel végzett kettős festéssel. Ez a kísérlet sikeres feloldódást mutat: a vérsejtek 95,2% -át és 95,0% -át a magzati májból nyert őssejtek helyettesítették. Kimutatták továbbá, hogy a CD19-pozitív B-limfociták, a CD3-pozitív T-limfociták és a CD11b-pozitív leukociták, például monociták, makrofágok, granulociták és természetes gyilkos sejtek hordozzák a CD45.1 felületi markert a magzati májsejt-transzplantáció után. Ha ezeket az alcsoportokat közelebbről elemezzük, akkor azt látjuk, hogy a CD11b és CD19 pozitív sejteket a donorsejtek több mint 99% -ra cserélték. Csak a T-sejtcsoportban van a befogadó sejtek körülbelül 4% -a, amelyek nagy valószínűséggel T-memória sejtek (7. ábra).
53 Eredmények TRAF2 és TRAF6 atherosclerosisban 7. ábra: A perifériás vérsejtek sikeres helyreállítása magzati májsejt-transzplantációval Az LDLR -/- egereket (CD45,2 pozitív/cd45.1 negatív, A) myeloablatív módon (2x450cGy) és magzati májsejtekkel sugározták napok óta régi magzatok (CD45.2 negatív, CD45.1 pozitív, B) helyreálltak. 4 héttel később az egereket elvéreztettük, és az átültetett állatok FACS-elemzését elvégeztük a CD45.1 és CD45.2 felszíni markerek (például C.
59 eredmény TRAF2 +/+/LDLR -/-: mm2, 0,53 ± 0,18 +/+ kontrollcsoport (TRAF2/LDLR Szintén TRAF2- őssejtek heterozigóta helyreállított TRAF2 és TRAF6 atherosclerosisban -/- N = 13, p = +/+ 0,56) a TRAF2/LDLR-ben mért -/- 2 értékhez képest: 0,41 ± 0,08 mm, N = 16). Azok a betegek, akiknél TRAF2-hiányos hasonló méretű ateroszklerotikus elváltozások voltak (TRAF2 -/-/LDLR -/- TRAF2-ben +/-/LDLR -/-: 0,48 ± 0,01 mm2, N = 17, p = 0,60, 12. ábra). Az érelmeszesedéses elváltozás nagysága mellett összetétele is nagy érdeklődésre tart számot, mivel befolyásolja a lepedék stabilitását. Ha megnő a lipidek aránya a lepedékben, ez az embernél a plakk-szakadás megnövekedett gyakoriságával jár. A TRAF2 hiány azonban nem befolyásolja az érelmeszesedéses elváltozások lipidtartalmát (12. ábra). B 0,08 p = 0, p = 0, TRAF2 +/+/LDLR-/TRAF2-ben +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/TRAF2-ben +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/TRAF2-ben +/-/LDLR -/- Olajvörös-O pozitív festés/a teljes érfal elváltozás mérete (mm 2) A 0,15 p = 0,54 p = 0, TRAF2 +/+/LDLR-/TRAF2-ben +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/TRAF2-ben +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/TRAF2-ben +/-/LDLR -/- C TRAF2 +/+/LDLR-/TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/TRAF2-ben +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/TRAF2-ben +/-/LDLR -/- 12. ábra: A TRAF2 hiány egyik sem befolyásolja a A méret még mindig befolyásolja az érelmeszesedéses elváltozások lipidtartalmát
66 Eredmények TRAF2 és TRAF6 atherosclerosisban A TRAF6 nem változtatja meg az ateroszklerotikus elváltozások összetételét, majd tesztelték a hipotézist, hogy a TRAF6 befolyásolja-e az érelmeszesedéses elváltozások összetételét. Emberben ennek következményei vannak az érelmeszesedéses elváltozások stabilitására és ezáltal hajlamára a repedésre. Ezért az étrend szerint szövettani metszeteket készítettünk, amelyek makrofágokra (17A. Ábra), lipidekre (17B. Ábra), simaizomsejtekre (17C. Ábra), kollagénekre (17D. Ábra) és T-sejtekre (17E. voltak. Kiderült, hogy a TRAF6 hiány nem befolyásolja az érelmeszesedés elváltozásának összetételét, mivel a három csoport között nem találtunk szignifikáns különbséget az összes elvégzett festésnél.
67 TRAF2 és TRAF6 eredmény ateroszklerózisban A Mac-3 pozitív terület (%) p = 0,23 p = 0,52 B Olaj-vörös-O pozitív terület (%) p = 0,58 p = 0,98 C α-aktin pozitív terület (%) p = 0,95 p = 0,16 D picrosirius redpositív terület (%) p = 0,36 p = 0,66 E 100 CD4 + sejtek/érfal p = 0,74 p = 0,21 TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 -/-/LDLR -/- TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 -/-/LDLR -/- TRAF6 +/-/LDLR -/- 0 17. ábra: A TRAF6 hiány megváltoztatja a lepedéket Nem myeloablatív módon besugárzott TRAF6 +/+/LDLR -/- egerek TRAF6 +/+/LDLR -/- (fehér sávok, N = 21) vagy TRAF6 -/-/LDLR -/- őssejteket kaptak (kikelt sávok, N = 21). A TRAF6 +/-/LDLR -/- egereket rekonstruáltuk TRAF6 -/-/LDLR -/- őssejtekkel (fekete oszlopok, N = 22). Ezt követően minden csoport 18 hétig koleszterinben gazdag étrendet kapott, amelynek végén immunhisztokémiai festéssel számszerűsítették az aorta gyökerei területén található ateroszklerotikus elváltozások összetételét. A makrofágok (A), a lipidek (B), a simaizomsejtek (C), a kollagén (D) és a T-sejtek (E) eredményeit egyesítjük és átlag ± SEM-ként mutatjuk be.
68 Eredmények TRAF2 és TRAF6 atherosclerosisban A TRAF6 nincs hatással az aterogenezisre a leszálló aortában és az aortaívben. Mivel az érelmeszesedés az érrendszer különböző pontjain eltérő módon alakulhat ki, a leszálló aortát a bifurkációig egy festés után elemezték az olaj-vörös-O segítségével megvizsgált lipidek mennyisége. A várakozásoknak megfelelően a hasi aortában nem volt különbség a TRAF6-hiányos (21,0 ± 2,9%, N = 8, p = 0,90) vagy a TRAF6-kompetens (20,5 ± 2) állatok között., 6%, N = 8) őssejteket ültettünk át. A TRAF6 +/-/LDLR -/- recipiensek, akik TRAF6-hiányos hematopoietikus őssejteket kaptak (25,2 ± 2,6%, N = 10, p = 0,23), szintén hasonló lipideloszlást mutattak, mint a kontrollcsoport (1. ábra). 18A és B). Még a szövettanilag elemzett aortaívekben is, a TRAF6-hiányos őssejtekkel átültetett állatok plakkmérete hasonló a kontrollcsoportéihoz (TRAF6 -/-/LDLR -/- a TRAF6-ban +/+/LDLR -/-: 0,012 ± 0,003 mm 2, N = 18, p = 0,85, TRAF6 -/-/LDLR -/- TRAF6 +/-/LDLR -/- (0,020 ± 0,006 mm 2, N = 16, p = 0,85, TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6-ban +/+/LDLR -/-: 0,013 ± 0,003 mm 2, N = 20, 18. ábra C és D).
69 TRAF2 és TRAF6 eredmény ateroszklerózisban 18. ábra: A TRAF6 hiány megváltoztatja a lipid eloszlást a hasi aortában és az ateroszklerotikus elváltozások méretét az aortaívben, nem myeloablatívan besugárzott TRAF6 +/+/LDLR -/- egerekben TRAF6 +/+/LDLR -/- (fehér oszlopok, N = 8) vagy TRAF6 -/-/LDLR -/- őssejtek (kikelt oszlopok, N = 8). A TRAF6 +/-/LDLR -/- egereket rekonstruáltuk TRAF6 -/-/LDLR -/- őssejtekkel (fekete oszlopok, N = 10). Ezt követően minden csoport magas koleszterinszintű étrendben részesült 18 héten keresztül, amelynek végén a hasi aorta érelmeszesedését elemeztük, miután Oil-Red-o-val festettük az arc lipidjeit. Az összesített eredményeket olaj-vörös-O formában adjuk meg a teljes területre ± SEM (A); a reprezentatív aortákat nagyítás nélkül fényképezzük az alsó sorban (B). A diéta után az aortaívek szövettani metszeteit készítettük és olaj-vörös-O-val festettük. Az ateroszklerotikus elváltozások összesített nagysága ± SEM a felső sorban látható (C), az alábbiakban reprezentatív Oil-Red-O festett szövettani metszetek négyszeres nagyítással (D).