Az oxidatív stressz gének expressziójának étrend által befolyásolt szabályozása sertésekben - PDF
1 Sertésekben az oxidatív stressz gének expressziójának étrend által befolyásolt szabályozása Értekezés a Rostocki Egyetem Matematikai és Természettudományi Karának doktori fokozatának doktor rerum naturalium (Dr. rer.nat.) Megszerzésére, előadó: Bianka Kurts-Ebert, született: 19 1975. február Neindorfban, Klingendorf Rostockból,
2 2 Lektor: Prof. Dr. Manfred Schwerin Kutatási Intézet a haszonállatok biológiájához (FBN) Igazgatóság/Tanszék Funkcionális Genomelemzés Wilhelm-Stahl-Allee Dummerstorf Prof. Dr. Siegl Edda Rostocki Egyetem, Biológiai Tanszék, Inst
3 TARTALOMJEGYZÉK Rövidítések listája Ábra lista Táblázatok Bevezetés A kutatás állapota Az anyagcsere és az egészség táplálkozási hatása Prenatális anyagcsere-programozás Korai posztnatális anyagcsere-programozás Tartós fiziológiai és anyagcsere-változások okai Metabolikus programozás örökletes képessége Metiláció Metabolikus programozás Metabolikus programozás DNS-metabolizálás A gén inaktiválásának mechanizmusa a kromatin modellezésével, a DNS metilációjának modellezésével, mint az étrendhez kapcsolódó perzisztens metabolikus hatások lehetséges molekuláris mechanizmusával Feladat Anyag és módszerek Kísérleti megközelítés: Diéták és állatok Nukleinsavak izolálása RNS izoláció Genom DNS izolálása
5 Tartalom 5 6. Megbeszélés Az étrenddel összefüggő, hosszan tartó változások az oxidatív stressz-reakcióban DNS-metilációban - a gén expressziójának tartós változásának mechanizmusa Összefoglalás Összefoglaló Irodalomjegyzék 149. függelék A. A beszerzés forrásai A.1 Berendezések A.2 Biológiai anyagok, vegyi anyagok, oldatok és pufferek
7 RÖVIDÍTÉSEK FELSOROLÁSA AARE Aminosav-válaszelem AC-acetilezés Acc. Nr. AP1 aktivátor fehérje 1 BHMT bp betain-homocisztein-metiltranszferáz bázispár CAS CANX cdna CpG kazein kalnexin másolás -Metil-transzferáz dpm pont per perc dntp (datp, dctp, dezoxiribonukleozid-5-trifoszfát dgtp, dttp) (A = adenozin, C = citozin, G = guanozin, T = timidin) DTT ditiotreitol [3H] dctp-deoxi-citin tetranátrium-só, [5,5 3H] EDTA etilén-diamin-tetraacetát
8 8 Rövidítések listája FBN FDR FP Kutatóintézet a haszonállatok biológiájához Fals Discovery Rate Feeding Period GSTA1 GR Glutation-S-Transferase A1 Glucocorticoid Receptor HDAC Histone Deacetylase HDL High Density Lipoprotein HMT Histonmethyltransferase HP1 Shock ICF Heat IG Heat TransFin 1 Transformer Factor 1 Immunhiányos centromerás régió instabilitása és arc anomáliák Inzulinszerű növekedési faktor kb kilobázis (n) LB LDL LT Luria Bertani Alacsony sűrűségű lipoprotein Élet napjai MBD MeCP mrna MS MSRA MTF 5MTHF Metilkötő domén Methyl-CpG-kötő fehérjék Messenger Ribonukleinsav Meth Reduktáz-A-metil-transzferáz-5-metil-tetrahidrofolát NfκB nukleáris faktor κb
9 Rövidítések listája 9 OATP2 szerves anion transzport polipeptid 2 PAC PCR P1 mesterséges kromoszóma polimeráz láncreakció repr. ROS rpm RT a CAR1-faktor reaktív oxigén faj represszora fordulat/perc Fordított transzkripció SAM S-adenozilmetionin SP1 Specifikus fehérje 1 SPI Szója TOT N, N, N tetrametil-etilén-diamin transzkripciós faktor Tris- (hidroxi-metil) -amino-metán USF URS Upstream Response Element Upstream Repressziós Szekvencia YAC élesztő Mesterséges Kromoszóma
10 10 Rövidítések listája
11 AZ ÁBRÁK FELSOROLÁSA 2.1 Az anyai táplálkozás hatása a magzat fejlődésére és a betegségekre gyakorolt hatások a poszt-reproduktív életszakaszban Fiziológiai változások, amelyek metabolikus programozáshoz és betegségekhez vezetnek az élet utáni reproduktív szakaszában Oxidatív stressz - a táplálkozással összefüggő, hosszú távú anyagcsere-változások lehetséges mechanizmusa Citozin-metiláció fehérjék mennyisége a kísérleti CAS- és SPI-diétákban Diéták és állatok Bimodális olvadási hőmérsékleti görbe példája A biszulfit-módosított genomi DNS szekvenciájának sematikus ábrázolása A biszulfit-kezelés után a DNS-szálak már nem komplementerek A citoszin uracillá történő biszulfit-indukálta hidrolitikus dezaminálásának kémiai szekvenciája Piroszekvenálási pirogram Az adott etetési csoportba tartozó állatok átlagos tömege (kg) az F megkezdése előtt etetési kísérlet és az egyes táplálkozási időszakok után Az oxidatív stresszválasz génjeinek májtranszkripciós szintje négy hét táplálkozás után az SPI-étrenden, majd később visszaváltva a CAS-étrendre a CAS-kontrollcsoporthoz képest
13 A TÁBLÁZATOK FELSOROLÁSA 2.1 Ontogenetikailag korai fehérjeszűkítés hatásai A metiláció fejlődése és szövetspecifikus változásai, valamint ezek hatása az expresszióra A metilációs rendellenességekből eredő szindrómák és rákok az imprinting mechanizmusban - Szuppresszor gén PCR ciklus a LICOR LightCycler PCR ciklus szekvenálásához az 5 verseny termék PCR ciklusának amplifikálásához a biszulfittal kezelt DNS amplifikálásához A GSTA1-PAC klónok izolálása A transzkripciós sebesség mérésére használt primerek Láncindítók az 5-nem lefordított terület szekvenálására. Láncindítók a PCR-termékek amplifikálására. Láncindítók a metilációs helyek szekvenálására. Láncindítók az 5-nem lefordított terület azonosítására. Korreláció együtthatók a vizsgált gének máj transzkripciós szintjétől és a sertések testtömegétől 76
14 14 Táblázatok felsorolása
21 2.1. Táplálkozási hatás az anyagcserére és az egészségre 21 2.2. Ábra: Élettani változások, amelyek anyagcsere-programozáshoz és betegségekhez vezethetnek az élet utáni reproduktív szakaszában. A pre- és korai posztnatális alultápláltság megváltozott hormonkoncentrációhoz vezethet, ami állandó metabolikus alkalmazkodást eredményezhet. Az étrenddel összefüggő fiziológiai hosszú távú hatások jelensége biztosítja a túlélést kedvezőtlen táplálkozási körülmények között, bár a programozás negatív hatással lehet az egészségre az élet utáni reproduktív szakaszában [9, 44].
24 24 2. A kutatás jelenlegi állása 2.3. Ábra: Oxidatív stressz - az étrenddel összefüggő, hosszú távú anyagcsere-változások lehetséges mechanizmusa A szójafehérje (SPI) alapú étrend, amelyet kiegyensúlyozatlan aminosavtartalom jellemez, megnövekedett oxidatív gének expresszióját okozza a növekvő sertések májában. Stresszválasz az oxidatív stressz indukciója miatt [25, 51, 95].
31 2.2. DNS metiláció: az anyagcsere programozásának lehetséges mechanizmusa 31 2.4. Táblázat: Példák a daganat fejlődésére a DNS hipermetilációja és a tumor szuppresszor gének inaktiválása révén Tumor szuppresszor Tumortípus (ok) Ref. P16 Orális carcinoma [185] p57kip2 Tüdő- u.brustkrebs [186] RASSF1A glioma karcinogén, emlőrák [187, 188] vesesejtes karcinóma [189] p16/rassf1a/hmhl1 intra- és extrahepatikus [190] GSTP cholangiocarcinoma APC emlőrák [188] DAP kináz emlőrák [191] hdab2ip ] Runx3 vastagbélrák [192] EXT1 leukémia, bőrrák [193] PTEN emlőrák [194] LOX gyomorrák [195] 2.4. Ábra: Citozin-metiláció A DNS-metil-transzferáz katalizálja a metilcsoport citozinná történő átvitelét. 5-metil-citozin képződik.