Az rv3131, egy dosr-regulon által kódolt feltételezett nitroreduktáz új vakcinázási potenciálja a
alanyok
absztrakt
bevezetés
Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk az Rv3131 immunogenitását és védőhatásait, amelyet egy jól definiált TLR4 adjuváns, a GLA-SE (Glucopyranosyl Lipid Adjuvant Stable Emulsion) formulázott, mint vakcinaplatform az alegységek számára a hipervirulens Mtb K expozíció ellen.
Eredmények
Az rv3131 transzkriptum az exponenciális növekedési fázisban, a hipoxiás állapotban és a makrofágokban szabályozatlan, függetlenül a virulens Mtb izolátum növekedési fázisától
38 kDa Rv3131-et nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) és Western blot (1c) alkalmazásával igazoltunk.
( a ) Az rv3131 expressziós szintjét qRT-PCR alkalmazásával értékeltük. Az Mtb H37Rv (világosszürke sáv) és az Mtb K (sötétszürke sáv) közötti különbözõ hajtogatási változásokat különbözõ növekedési, exponenciális fázisú és hipoxikus tenyésztési körülmények között a ΔΔCt módszerrel határoztuk meg, és endogén kontrollként a 16S rRNS expressziót alkalmaztuk. Az Rv3133c-t (dosR) használtuk pozitív kontrollként. ( ) A qRT-PCR-t használták az Mtb rv3131 expressziójához is a BMDM-eken belül. Az Mtb H37Rv (világosszürke sáv) és az Mtb K (sötétszürke sáv) közötti különbözõ hajtogatási változásokat ΔΔCt módszerrel határoztuk meg, és endogén kontrollként a 16S rRNS expressziót alkalmaztuk. Az Rv3133c-t (dosR) használtuk pozitív kontrollként. ( c ) Coomassie kékkel festett 10% SDS-PAGE rekombináns Rv3131 fehérjével (bal oldali panel), endotoxinmentes körülmények között tisztítva és Western-blot segítségével antihisztidin antitesttel (jobb oldali panel) megerősítve. M: molekulatömeg standard marker.
Rv3131 immunizációval kiváltott immunogenitás és immunológiai memória
Az egerek minden csoportját immunizáltuk és eutanizáltuk a módszerek részben leírtak szerint. Négy héttel az utolsó immunizálás után az egyes csoportokba tartozó egereket leöltük, és tüdő- és lépsejtjeiket Rv3131-gyel (5 μg/ml) kezeltük 37 ° C-on 12 órán át Golgi Stop jelenlétében. ( a ) Az Ag-specifikus multifunkcionális T-sejtpopulációk azonosítására használt kapuzási stratégia. ( ) Az Ag Rv3131 vakcinával stimulálva az Ag-specifikus, multifunkcionális CD4 + CD62L és CD8 + CD62L T-sejtek százalékos aránya, amelyek TNF-, IFN- & g; és/vagy az IL-2 termelődését az egyes immunizált csoportok tüdő- és lépsejtjeiben áramlási citometriával értékeltük. Az effektor citokineket termelő sejtek átlagos gyakoriságát kördiagramként mutatjuk be. Az eredményeket átlag ± SD-ként fejezzük ki minden csoportból 5 egér esetében. A különbségek jelentőségét párosítatlan t-teszttel határoztuk meg. A p-érték
Ezenkívül a kiterjedt genetikai variációk megváltoztathatják az oltóanyag hatékonyságát és a génexpressziós útvonalakat, amelyek fontosak a TB oltás kifejlesztése szempontjából. Például Cohen és mtsai. előrejelzése szerint a mikobaktériumtörzsek sokféleségének hiányos megértése jelentős negatív hatással lehet a vakcina hatékonyságára, mivel a vakcina az Mtb nem célzott variánsait helyettesíti a 38 törzzsel. Emellett Homolka és mtsai. azt javasolta, hogy az Mtb törzsek genetikai sokfélesége megerősítse annak szükségességét, hogy kezelni kell a különböző Mtb törzsek használatának kihívását, mint közös lépést az oltástesztelésben és a gyógyszervizsgálatban 39 .
Ezért feltételeztük, hogy a klinikailag domináns Mtb genotípus és a törzsspecifikus túlzottan expresszált Ag-k jó vakcina-cél Ag-k lehetnek. Végül a génátiratok mikroarray elemzésével azonosítottuk, hogy az Rv3131 megfelel a fenti normának a DosR regulon által kódolt gének között. Legjobb tudomásunk szerint ez az első alkalom, hogy a DosR regulonnal kapcsolatos Rv3131 hatékonyan hat a kihívásra egy nagyon virulens klinikai Mtb törzsből Pekingben.
Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy az Rv3131 termelt-e Ag-specifikus IFN-y-t az Mtb K fertőzés során. -Reakció (2a) és milyen típusú T-sejt-válasz vált ki az Rv3131-gyel és a GLA-SE-vel (2, 3 és 4) 5) végzett vakcinázással a fertőzés előtt és után. Vizsgálatunk kimutatta, hogy az Rv3131 Ag-specifikus IFN-y választ váltott ki Mtb K fertőzés során, és hogy az Rv3131 és GLA-SE oltás erős Ag-specifikus memória T-sejt választ váltott ki. Ezenkívül az Rv3131 alegység elleni vakcina robusztus és tartós Th1 alapú memóriaválaszt (2., 3. és 5. ábra) és hasonló védőhatást váltott ki az Mtb K ellen, szemben a BCG által kiváltott védelemmel, mint egyetlen Ag alegység elleni oltás 4 Hetek az oltás után. Fertőzés (4. ábra).
Nemrégiben Zvi és mtsai. arról számoltak be, hogy az Mtb genom 3989 ORF termékéből 189 gént választottak ki in silico feltételezett vakcinajelöltként a széleskörű adatbányászat és a bioinformatika révén létrehozott genomskála szerinti adatok alapján 44. A 189 oltójelölt közül az Rv3131 és az Rv3127, egy másik DosR regulon-kódolású nitroreduktáz, valamint a transzkripciós profil vizsgálatunk második legmagasabb génje került a 45 legnépszerűbb találat listájába. Az elméleti elemzés mellett a kísérleti bizonyítékok azt mutatják, hogy az Rv3131 egy T-sejt Ag. Például az Rv3131 által kiváltott, Mtb-specifikus T-sejt immunválaszokat beszámolták tuberkulin bőrpróba pozitív egyéneknél, de egészséges kontrolloknál vagy TB betegeknél nem. Másik példaként az Rv3131 mutatta a legimmunogénebb Ag-potenciált, összehasonlítva a többi, DosR-rel kapcsolatos Ag-val, amelyek tesztelték az IFN-γ indukálására való képességüket egy látensen fertőzött gambiai populációban 46 .
Összefoglalva, jelenlegi adataink azt mutatják, hogy a DosR-kódolású Rv3131, a TB oltóanyag-fejlesztés új cél Agja, hatékony vakcina Ag-ként képes a következő kritériumoknak megfelelni: konstitutív és stabil expresszió hiper-virulens Peking Mtb-ben; az immunrendszer felismerésének képessége in vivo fertőzés során; képesség az Ag-specifikus, Th1-előfeszített multifunkcionális T-sejtek kiváltására; és hatékonyság a hiper-virulens Mtb törzsekkel szemben. Ezért az Rv3131 kiváló jelölt lehet több Mtb alegység-antigént tartalmazó vakcinában történő alkalmazásra, különös tekintettel a BCG vakcina korlátozott hatékonyságára a pekingi család ellen.
Mód
Állatok
Valamennyi állatkísérletet a Koreai Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatal (KFDA) irányelveinek és előírásainak megfelelően hajtották végre. A kísérleti protokollokat a Yonsei Egyetem Egészségügyi Rendszerének (Szöul, Korea) intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága (Engedélyszám: 2015-0041) vizsgálta felül és hagyta jóvá. A vizsgálatok jóváhagyása után 6-7 hetes nőstény C57BL/6 kórokozó nélküli egereket vásároltunk a Japan SLC, Inc.-től (Shizuoka, Japán), és azokat gátolt körülmények között az Avison Biomedical Research BSL-3 létesítményében helyeztük el. A Yonsei Orvostudományi Főiskola központja.
Baktériumtörzsek és bakteriális RNS termelése
Microarray kísérletek és elemzések
Az Mtb oligoarray diákat szívesen nyújtotta dr. Stefan HE Kaufmann (Max Planck Infektológiai Biológiai Intézet, Berlin, Németország). Az RNS jelölését és a tömbhibridizációt a korábban leírt módon hajtottuk végre 59. A hibridizált tárgylemezeket egy GenePix 4000B microarray szkennerrel (Axon Instruments, CA, USA) szkenneltük, és a foltintenzitásokat a TM4 Microarray Software Suite (//www.tm4.org) segítségével azonosítottuk és számszerűsítettük. A pontjel intenzitását a MIDAS-ban normalizáltuk a LOWESS algoritmus opcióival és a teljes mező intenzitással. A statisztikai elemzéshez négy biológiai replikációs tömböt használtunk exponenciális növekedési körülményekhez és három biológiai replikátumot hipoxiás tenyésztési körülményekhez.
BMDM-ek generálása és in vitro fertőzés
BMDM-eket a korábban leírt módon állítottunk elő 61. 6 nap elteltével a differenciált BMDM-eket Mtb H37Rv-vel és K-vel fertőztük 10 MOI mellett 24 órán át.
Az rv3131 expressziójának megerősítése qRT-PCR segítségével
A teljes Mtb H37Rv és K-RNS-t az exponenciális növekedési fázisból extraháltuk hipoxia és Mtb-vel fertőzött BMDM-ek alatt Trizol alkalmazásával, a fentiek szerint. A cDNS-t ezután egy RT & GO master mix (MP Biomedicals, Németország) segítségével szintetizálták a szállító ajánlásai szerint. A szintézis után az Mtb H37Rv és K közötti differenciális génexpressziót qRT-PCR alkalmazásával mértük, amint azt korábban leírtuk 62. Röviden: a qRT-PCR-t egy StepOnePlus ™ valós idejű PCR rendszeren (Applied Biosystems, CA, USA) hajtottuk végre, SYBR® Premix Ex Taq ™ II (Takara Bio Inc., Shiga, Japán) alkalmazásával. a qRT-PCR-t a következő primerkészletek alkalmazásával hajtottuk végre; rv3131 előre, 5'-GTGCCCTAGACCGAATGAAA-3 'és hátra, 5'-TAGCGCCACTCCAAATG-3', dosR (rv3133c) előre, 5'-AGACATCAAGGGAATGGAGTTG-3 'és hátra, 5'-TGGGTGTGTGTGTGTGTGGTGT 3 'és hátrafelé, 5'-CGGGACTTAACCCAACATCTC-3'. Az Mtb H37Rv és az Mtb K közötti génexpresszió szeres változását ΔΔCt módszerrel számoltuk, és a normalizáláshoz 16S rRNS-t használtunk. Három biológiai ismétlést alkalmaztunk statisztikai elemzéshez.
Rekombináns Rv3131 fehérje expressziója és tisztítása
Egerek immunizálása
A C57BL/6 egereket három intramuszkuláris injekcióval immunizáltuk, három hét különbséggel. Minden immunizálás 5 μg rekombináns Rv3131 fehérjét és 5 μg GLA-SE-t (glükopiranozil-lipid adjuváns) tartalmazott, amelyet az IDRI (Infektív Betegségkutató Intézet) stabil olaj-a-vízben emulziójában (SE) készítettek. A GLA-SE-t szívesen adta az IDRI (Seattle, WA, USA). A BCG immunizálásához az egereket szubkután 2 x 105 CFU BCG Pasteur 1173P2-vel injektáltuk. Az egerek kontroll csoportját csak GLA-SE-vel immunizáltuk. A lép- és a tüdõsejteket összegyûjtöttük és az immunizálás analíziséhez 4 héttel az utolsó immunizálás után használtuk fel.
Mtb fertőzés
Négy héttel az utolsó immunizálás után az adjuváns kontrollt (GLA-SE) és a beoltott egereket (BCG, Rv3131/GLA-SE) aerogén módon megfertőztük az Mtb K törzzsel, amint azt korábban leírtuk 63. Röviden: az egereket Mtb K-nak tettük ki 60 percig egy előre meghatározott dózis leadására kalibrált levegőfertőző eszköz (Glas-Col, Terre Haute, IN) inhalációs kamrájában. A kezdeti baktériumterhelés igazolásához egy nappal később négy egeret eutanizáltak, és körülbelül 150 életképes baktériumot engedtek ki minden egér tüdejébe.
Citokin mérés
Az Mtb-vel fertőzött vagy immunizált egerek lépéből és tüdejéből előállított egysejteket Rv3131-gyel (5 μg/ml) vagy PPD-vel (2 μg/ml) stimuláltuk 24 órán át 37 ° C-on. A PPD-t dr. Brennan Aeras-nál (Rockville, MD, USA). A szekretált IFN-γ (eBioscience, San Diego, CA), IL-4 és IL-5 (BD Bioscience, San Diego, CA) szintjét a tenyészet felülúszójában kereskedelmi ELISA készlet segítségével detektáltuk a gyártó utasításainak megfelelően.
Antitest-titerek a szérumban
A szérumban található Rv3131-specifikus IgG1 és IgG2c reakciókat a korábban leírtak szerint értékeltük 63. Röviden: a 96 lyukú lemezeket 2-vel töltöttük meg. g/ml Rv3131 bevont; Torma-peroxidázzal (HRP) konjugált antitestet IgG1 (BD Bioscience, San Diego, CA) vagy IgG2c (Southern Biotech, Birmingham, AL) ellen használtunk másodlagos antitestként. Az optikai sűrűségeket (OD) 495 nm-en határoztuk meg a reakció befejezése után 15 percen belül.
A T-sejt szubpopulációk elemzése
A tüdő- és lépsejtek egysejtű szuszpenzióit a korábban leírt módon állítottuk elő 65. Az egysejtű szuszpenziókat először anti-CD16/32-gyel blokkoltuk 15 percig 4 ° C-on. Miután a sejtfelületet LIVE/DEAD ™ -rel rögzíthető Aqua-Dead-Cell-Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), Brilliant Violet 421 (BV421) konjugált anti-CD3? -Peridinin-klorofill (PerCP) -Cy5,5-konjugált anti-CD4, allofikocianin (APC) -Cy7-konjugált anti-CD8 (BD Bioscience, San Diego, Kalifornia), phycoerythrin (PE) -konjugált anti-CD44, APC konjugált anti-CD127 és fluoreszcein-izotiocianát (FITC) konjugált anti-CD62L (eBioscience, San Diego, CA) antitest 30 percig 4 ° C-on, az egyes memória T-sejtek számát FACSVerse- Áramlási citométereket (BD Biosciences) és kereskedelemben kapható szoftvereket (FlowJo) elemeztünk.
Intracelluláris citokin festés
Az immunizált és fertőzött egerek (2x106 sejt) egysejtes szuszpenzióit Rv3131-gyel (5 μg/ml) vagy PPD-vel (2 μg/ml) stimuláltuk 37 ° C-on 12 órán keresztül GolgiStop (BD Bioscience) jelenlétében. A sejteket először PBS-sel mostuk, anti-CD16/32 blokkoló antitesttel blokkoltuk 4 ° C-on 15 percig, majd a felületet fluorokrómmal jelölt antitestekkel festettük CD3, CD4, CD8 és CD62L, valamint a LIVE/DEAD TM Fixable Aqua Dead ellen. Sejtkészlet 30 percig 4 ° C-on. Negatív kontrollként a sejteket a megfelelő izotípus-megfelelő immunglobulinnal (Ig) festettük a felületre. A sejteket Cytofix/Cytoperm-rel (BD Biosciences) 30 percig 4 ° C-on mostuk, fixáltuk és permeabilizáltuk. A sejteket kétszer mossuk Perm/Wash-szal (BD Biosciences), majd intracellulárisan festjük APC-konjugált anti-TNF-a, PE-konjugált anti-IFN-y és PE-Cy7-konjugált anti-IL-2-vel (BD Biosciences). 30 perc 4 ° C-on. A sejteket Perm/Wash mosással mossuk, majd IC fixációs pufferrel (eBioscience) rögzítjük. A PBS-ben történő újraszuszpendálás után a sejteket áramlási citométerrel elemeztük.
Bakteriális felsorolás és hisztopatológiai elemzés
Statisztikai analízis
Minden in vitro eredmény legalább három független kísérletet reprezentál, következetes eredményekkel. A grafikonon szereplő adatok az átlag ± szórás (SD) formájában vannak feltüntetve. Az in vivo kísérlet adatait interkvartilis tartomány (IQR) mediánjaként adjuk meg. A minták összehasonlítását párosítatlan t-teszt vagy egyirányú ANOVA alkalmazásával követte Tukey többszörös összehasonlító tesztje, amikor az adatokat általában a Prism 5 (GraphPad Software version 5, San Diego, CA) segítségével osztották szét.
további információ
Hogyan idézhetem ezt a cikket: Kwon, KW és mtsai. Az Rv3131, egy DosR regulon által kódolt feltételezett nitroreduktáz új vakcina-potenciálja a hiper-virulens Mycobacterium tuberculosis K. Sci törzs ellen. ismétlés. 7., 44151; doi: 10.1038/srep44151 (2017).
A szerkesztő megjegyzése: A Springer Nature semleges marad a közzétett térképeken és az intézményi kapcsolatokban szereplő joghatósági igények tekintetében.
További információ
Word dokumentumok
További információ
Megjegyzések
Megjegyzés benyújtásával elfogadja a felhasználási feltételeket és a közösségi irányelveket. Ha valami visszaélést tapasztal, vagy nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.