Élelmiszerfehérjék enzimatikus oligomerizációja nagynyomású reakció helyeken és
Élelmiszerfehérjék enzimatikus oligomerizációja nagy nyomás alatt: reakcióhelyek és funkcionális következmények ÉRTEKEZÉS az akadémiai fokozat megszerzéséhez Doktor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) A Drezdai Műszaki Egyetem Matematika és Természettudományi Karának bemutatta Susanne Schuh. 2007 szeptemberétől 2012 júliusáig az Élelmiszerkémiai Professzori Egyetemen.
Disputáció: 2013. április 25. Lektor: Prof. Dr. rer. nat. Dr.-Ing. habil. Thomas Henle Prof. Dr. rer. nat. Harshadrai Ravel
Tartalom-jegyzék Tartalom-jegyzék V ábra-táblázat VIII-as rövidítések listája XI 1 Bevezetés és célok 1 2 Elméleti alapelvek 3 2.1 Lizozim. 3 2.1.1 A lizozim hatásmechanizmusa. 4 2.1.2 A lizozim lehetséges felhasználási módjai. 7 2.1.3 A lizozim módosulása. 8 2.1.3.1. A HEWL fibrillái és amiloid struktúrái. 9 2.1.3.2 Új biológiai funkciók a konformációs változások révén. 13 2.1.4 Evolúciós fejlődés és az α-laktalbuminnal való kapcsolat. 14 2.2 Az enzimatikus térhálósodás. 15 2.2.1 Mikrobiális transzglutamináz. 15 2.2.1.1. TGáz által katalizált reakciók és reakciómechanizmus. 17 2.2.1.2. Analitikai szempontok. 19 2.2.1.3 Használat az élelmiszeriparban. 19 2.3 Nem enzimatikus térhálósodás. 21 2.3.1 Termikusan indukált térhálósodás. 21 2.3.2 In-Vacuo nulla hosszúságú keresztkötés. 23 2.3.3 A nem enzimatikusan kapcsolt fehérjék lehetséges felhasználása. 23 2.4 A magas hidrosztatikus nyomás hatása a fehérjékre. 24 2.4.1 A nagy nyomás hatása a csirke fehérje lizozimjára. 26 2.4.2 A nagy nyomás hatása a mikrobiális transzglutaminázra. 27 3 Kísérleti rész 29 3.1 Vegyszerek, anyagok, eszközök és szoftverek. 29 3.1.1 Vegyszerek. 29 3.1.2 Eszközök és fogyóeszközök. 31 3.1.3 Vizsgálóanyagok. 33 3.1.4 Szoftver. 33 I.
Tartalomjegyzék 4.6.2 A képződött izopeptidek azonosítása. 145 4.6.3 A HEWL nem enzimatikus és enzimatikus térhálósításának összehasonlítása ... 146 4.6.4 A HEWL in vákuumban végzett termikus térhálósításának összehasonlítása β-kazeinnel és elsõ vizsgálatok tejsavófehérje izolátumon. 149 4.7 Különböző fehérjék enzimatikus és nem enzimatikus térhálósításának vizsgálata. 152 5 Összefoglalás 154 6 Irodalomjegyzék 157 Publikációk 172 Köszönetnyilvánítás 173 Biztosítás 174 IV
Rövidítések listája LMW α-la β-lg Lys m/z Met min ML MMW MO MPa MS mtgáz NRT PBS PCR pdb rel. PE RP-HPLC fordulat/perc SDS-PAGE TCA TEMED TGáz ThT TPCK Tris U UV Val WHO Z-Glu-Gly ZLCL alacsony térhálósított lizozim minta 1000 37 C-os Arnaudov és de Vries, 2005 ph 2.0; 57 ° C 4,0 ± 0,7> 5000 Wang és mtsai. 2009a ph 2.0; 55 ° C
10 * 1000 * Frare és mtsai, 2004 ph 2.0; 65 ° C
10 *> 600 * Cao és mtsai, 2004 pH 4,5; Szobahőmérséklet; piros. HEWL, 90% etanol Goda et al., 2000 90% etanol, 10 mm NaCl, 25 C * becsült TEM képek alapján 2-5 1000-2000
2 Elméleti alapok Emellett Menéndez (2006) képes volt megmutatni, hogy alacsonyabb 20 C és 600 MPa hőmérsékleten az 50% -os inaktiváláshoz szükséges idő 100 perc körüli időre (hatszorosára) nő. Ezenkívül az enzimet csak szobahőmérsékleten 400 MPa-tól vagy 60 C-os légköri nyomáson mérhető mértékben gátolják. Ezen megállapítások alapján a transzglutamináz nyomásérzékenysége növekszik a hőmérséklet növekedésével (20 C). Az mtgáz inaktiválását tehát jobban befolyásolja a hőmérséklet, mint a nyomás, és elsőrendű reakciót követ (Lauber és mtsai, 2001a). A teljes dezaktiválás légköri nyomáson történik 2 perc és 80 ° C után (Menéndez et al., 2006). A nyomás okozta inaktiválás az α-hélixek lebomlásán alapszik az enzim felületén, ami megváltoztatja a tercier struktúrát, ami viszont befolyásolja a szubsztrát kötődését (Menéndez et al., 2006). A HEWL-vel ellentétben a nagynyomású kezelés utáni újratekerés nem teljes, mivel a nyomás csökkentésekor az aktivitásvesztés továbbra is fennáll. 28.
75%, T3516 Sigma-Aldrich, Steinheim Thymol 3209.1 Carl Roth, Karlsruhe TPCK-val kezelt tripszin szarvasmarhából 10000 BAEE egység/mg Sigma-Aldrich, Steinheim hasnyálmirigy fehérje, T1426 triklór-ecetsav (TCA) analitikai reagens VWR, Darmstadt N-Tris (hydrox metilglicin analitikai minőségű Serva Elektroforesis, Heidelberg (Tricin) trinátrium-foszfát-dodekahidrát tiszta, pa VEB Laborchemie, Apolda Tris (hidroxi-metil) -amino-metán (TRIS) puffer, A1379 AppliChem, Darmstadt 30
3 Kísérleti rész 3.1.3. Vizsgálati anyagok 3-4. Táblázat: Peptidek, fehérjék és fehérjekeverékek Név Specifikáció, katalógusszám Gyártó Lacprodan Alpha-10 (tejsavófehérje izolátum) 45,1% α-laktalbumin 45,9% β-laktoglobulin ARLA Foods Ingredients amba, Viby, Dánia Aspartyllysine 94,30% szintézis Dr. M. Hellwig, TU drezdai glutamil-glicin G1970 Bachem lizozim a tojásfehérjéből (HEWL)
70 000-96 500 U/mg, 62971 Sigma-Aldrich, Steinheim α-laktalbumin
85% -os izolálás tejsavófehérje-izolátumtól (3.4. Fejezet) α-laktalbumin szarvasmarha tejből> 85% Sigma-Aldrich, Steinheim β-kazein Aschaffenburgig (1963). C. Partschefeld, TU Drezda β-laktoglobulin szarvasmarha tejből
90% (OLDAL) Sigma-Aldrich, Steinheim 3-5. Táblázat: Mikroorganizmusok az Allgemeine Biochemie törzsgyűjteményéből, Technische Universität Dresden név Specifikáció Színezés Gram Origin szerint Bacillus sphaericus - gramm pozitív talajminta Degussa (Antwerpen) Bacillus subtilis - gram-pozitív Süohenheimi Egyetem, Hichia Egyetem coli TG 1 gramm negatív nem ismert Pseudomonas putida ATCC 17390 gramm negatív Mikrobiológiai Intézet, Hohenheimi Egyetem Streptococcus lactis B 23/2/1 gramm pozitív nem ismert 3.1.4 Szoftver 3-6: Alkalmazott szoftver Alkalmazás aminosav elemzés (ASA) Elektroforézis (SDS-PAGE) Fluoreszcencia mérés (ThT, ANS assay) Gélpermeációs kromatográfia (GPC) görbeillesztés, UV spektrum (CD) Tömegspektroszkópia (ESI-TOF-MS) Felületi hidrofóbicitás (ANS) Program Chromstar 6.3, SCPA GmbH Totallab TL 120 v2006c, Wincats, USA FL Solutions, Hitachi UV/VIS spektrumok (kongói vörös) Aspect Plus 1.7 (1993-2000) Eurochrom 2000, 2.05 verzió, Knauer, Geräteechnik Berlin J-700 for Window s Standard Analysis, 1.35.01 verzió, JASCO Corp. és CDPro, CONTIN módszer Számítógéppel támogatott adatgyűjtés ChemStation for LC 3D alkalmazással, Agilent Technologies, Böblingen Evaluation Data Explorer 4.0.0.1 verzió, Applied Biosystems, Foster City, USA Tecan i-control TM 33
3. kísérleti rész 3-9. Táblázat: Koncentrációs sorok a kalibráló oldatokhoz Koncentráció L-glutaminsav-γhydroxamate [mm] Kalibrációs törzsoldat [µl] Trisz-acetát puffer [µl] UV-abszorpció λ = 525 nm 2,5 1000 0 0,742 2,0 800 200 0,578 1,5 600 400 0,441 1,0 400 600 0,295 0,5 200 800 0,146 vak érték 0 1000 - Az mtgáz oldathoz (40 U mtgáz/100 ml) kb. 50 mg mtgáz 10 ml 0,2 M Tris-ben - Oldott acetátpuffer. Kalibrálás 1 ml kalibráló oldatot összekevertünk 1 ml stopreagenssel, és a vak értékhez mértük λ = 525 nm hullámhosszon (3-2. Ábra). Mindig kettős meghatározást hajtottak végre. 3-2. Ábra: Kalibrációs vonal: Az UV-abszorpció függősége λ = 525 nm-nél az L-glutaminsav-γ-hidroxamát 40 koncentrációjától
3. Kísérleti rész Fotometriai meghatározás 50 µl vizes mintaoldatot 950 µl NaOH-val pipettáztunk egy Eppendorf-csőbe, és összekevertünk 500 µl Lowry-oldattal. 10 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után 500 μl Folin-reagenst adunk hozzá, és az oldatokat homogenizáljuk. Az abszorpciót 2 órán át 660 nm-en végzett inkubálás után mértük az Ultrospec 1000 spektrofotométerben (Pharmacia Biotech, Freiburg). A kalibrációs vonalat ugyanazon körülmények között hoztuk létre 20-600 ug/ml fehérje/ml koncentrációval (3-10. Táblázat és 3-3. Ábra). 3-10. Táblázat: Pipettázási séma a fehérje meghatározásához a Lowry HEWL-koncentráció [µg/ml] HEWL törzsoldat [µl] NaOH [µl] UV-abszorpció λ = 660 nm-es vak értéke - 1000 0 20 20 980 0,066 ± 0,003 50 50 950 0,136 ± 0,015 100 100 900 0,250 ± 0,005 300 300 700 0,684 ± 0,060 400 400 600 0,827 ± 0,026 600 600 400 1,146 ± 0,032 minta 50 * 950 - * 50 µl mintaoldat 1:20 hígításnak felel meg a teszt térfogata alapján Kalibrálás 3. ábra -3: kalibrációs vonal, az λ = 660 nm-es UV-abszorpció függése a HEWL koncentrációjától [µg/ml] 43
3 Kísérleti rész 3-15. Táblázat: Elválasztási program az aminosavak, lítiumrendszer meghatározásához Idő [perc] 1. puffer 2. puffer 3. puffer 4. oszlop kemence hőmérséklete [C] 0 85 15 0 0 42 3 85 15 0 0 42 4 79 21 0 0 42 21 43 57 0 0 42 25 43 57 0 0 42 33 0 0 100 0 39 0 0 0 100 40 60 43 0 0 68 32 46 74 63 0 0 68 32 74 Az izopeptidek azonosítása és mennyiségi meghatározása: Pharmacia LKB Alpha Plus Oszlop: Kationcserélő kromatográfia oszlop: 190 x 4,6 mm PEEK 7 µm gyantával, 11% térhálósító mintapufferrel: nátrium-citrát 0,2 N, ph 2,20 Injektálási térfogat: 20-100 µl Eluensek: lásd 3-16. Táblázat Áramlás: 20 ml/h Elúciós program: lásd 3-17. táblázat: Detektálás: Oszlop utáni derivatizálás ninhidrinnel, tekercs hőmérséklete 135 C, mérés: 570 nm Ninhidrin reagens: Sykam, Fürstenfeldbruck A ninhidrin reagens áramlása: 0,18 ml/perc Értékelés: Chromstar 6.3 3-16. táblázat: A Nátrium-rendszer az Asp_Lys és Glu_Lys pufferkészítmény összetételének molaritása pH-mintapuffer meghatározására nátrium-citrát 0,2 2,20 1 nátrium-citrát 0,2 3,16 2 nátrium-citrát 0,2 4,03 3 nátrium-citrát nátrium-kloriddal 1,2 6,14 4 nátrium-hidroxid 0,4 48
3 kísérleti alkatrész-paraméterek mérése: Szkennelési mód: Adatmód: EX WL: EM Start WL: EM Vége WL: Szkennelési sebesség: Késleltetés: EX Rés: EM Rés: PMT Feszültség: Válasz: Hullámhosszú Pásztázási Kibocsátás Fluoreszcencia 370 nm 400 nm 600 nm 240 nm/perc 0 s 5 nm 5 nm 700 V 0,01 s kalibrálás 3-4. ábra: Az ANS vizsgálat kalibrációjának fluoreszcencia mérése 1900 µl ANS oldattal (250 µm) és 100 µl mintával, λ ex = 370 nm és λ em = 480 nm, kezeletlen HEWL, összehasonlítva a HEWL-vel, 96 órás fibrillálás után (Wang és mtsai., 2009b szerint), különböző koncentrációkban, vak érték korrigálva. A jel enyhe növekedése, amikor a kezeletlen HEWL koncentrációja megemelkedett, azon a tényen alapult, hogy a reagens valamivel több hidrofób kötési hely állt rendelkezésre. Fibrillált HEWL jelenlétében azonban szignifikánsan erősebb, lineáris növekedést találtak (3-4. Ábra). 3.7.9.2 Kongói vörös vizsgálat Ez az UV/VIS-alapú teszt egy kongói vörös oldat abszorpciójának növekedését mutatta ki 540 nm-en, amiloid fibrillák jelenlétében (Wang et al., 2009a). 58
3 Kísérleti rész A 100 μm-os tioflavin-T törzsoldatot 1,6 mg tioflavin T-ből (ThT) készítettük 50 ml PBS-pufferben. A törzsoldatot ezután PBS pufferral 1:10 (v/v) -ra hígítottuk, hogy a 10 μm-os ThT-oldatot kapjuk. Végrehajtás 80 μl 0,05% -os erősségű mintaoldatot (v/v) összekevertünk 1920 μl ThT oldattal, homogenizáltuk és közvetlenül a fluoreszcencia mérésére használtuk. 440 nm gerjesztési hullámhossz mellett az F-4500 fluoreszcencia spektrofotométerrel 450-530 nm emissziós spektrumot rögzítettünk. A matematikai értékeléshez 485 nm-en a fluoreszcencia intenzitást használtuk, a vak érték meghatározásához sóoldatot (pH 2,2, lásd 3.3) adtunk a 80 µl-es mintaoldat helyett. Mérési paraméterek: Szkennelési mód: Adat üzemmód: EX WL: EM Start WL: EM End WL: Szkennelési sebesség: Késleltetés: EX Rés: EM rés: PMT Feszültség: Válasz: Hullámhosszú szkennelési emisszió fluoreszcencia 440 nm 450 nm 530 nm 6 nm/perc 0 s 5 nm 5 nm 700 V 0,01 s kalibrálás 3-6. Ábra: A ThT vizsgálat kalibrálása 1920 µl ThT oldattal (10 µm) és 80 µl mintával, λ ex = 440 nm és λ em = 485 nm, Kezeletlen HEWL a HEWL-hez képest, 96 órás fibrillálás után (Wang és mtsai., 2009b szerint), különböző koncentrációkban, a vak érték korrigálva 60
4 A térhálósítás eredményei és megbeszélése: az 50 mm-es pufferek teljesítettek a legjobban, trimerekkel a Bis-Tris pufferben és tetramer nyomokkal a Tris rendszerben. Elképzelhető lenne az is, hogy az 50 mm-es Tris-HCl pufferben megfigyelt kissé megnövekedett pH-csökkenés a jó térhálósodás első jele volt. A térhálósodás következtében bekövetkezett pH-csökkenés oka az volt, hogy az izopeptidkötés kialakulása után néhány bázikus aminosavmaradék már nem volt hozzáférhető az oldószerek számára. A szóban forgó lizin és glutamin maradványok és környezetük tárgyalása a 4.2.3. Fejezetben következik. A különböző puffer rendszerek eredményei alapján az 50 mm-trisz-hcl-puffer esetében a HEWL legmagasabb keresztkötése mtgázzal volt kimutatható, ezért ezt választottuk. Ez azt jelenti, hogy a 7,2 és 9,0 közötti pH-értékeket általában Tris-alapú pufferrendszerekkel lehet elérni, mivel az említett puffer ezeken a határokon belül stabil (Good et al., 1966). Ezenkívül a kiválasztott ph értéknek alkalmasnak kell lennie a tervezett kísérletekhez. A lizozim izoelektromos pontja (pi)
37,5 perc) és metionint (Met, Rt
43 perc) majdnem az alapvonalakat detektáltuk külön. A natív HEWL-ben 78 van ezen a ponton
4 Eredmények és megbeszélés 4-10. Ábra: A triptikusan emésztett HEWL RP-HPLC: A - kezeletlen HEWL; B - HEWL mtgázzal 30 percig 40 C-on és atmoszférikus nyomáson kezelve; C - HEWL mtgázzal 30 percig, 40 ° C-on és 600 MPa (LMW) 4-8. Táblázat: A natív HEWL-ből származó triptikus peptidek azonosítása RP-HPLC-vel ESI-TOF-MS-rel Csúcsidő [perc] m/z triptikus [M + H] + [M + 2H] 2+ peptidek Elméleti peptidtömeg 1 5,1 517,3-69-73 516,27 2 10,3 448,3-126-129 447,23 3 12,8 606,4- 1-5 605,36 4 13,0 874,5 437,7 15-21 873,41 5 13,5 776,4-117-123 775,35 6 14,5 1428,9 714,9 34-45 1427 .64 7 14.7 836.5-6-13 835.39 8 15.1 992.7 496 .8 6-14 991.49 9 16.5 1045.7 523.3 117-125 1044.53 10 16,9 936,5 468,7 62-68 935,37 11 17,0 1276,7 638,9 115-125 1275,64 12 17,4 1754,6 877,5 46-61 1752,83 13 19, 3 1268,7 634,9 22-33 1267,60 14 19,8 1805,1 902,6 97-112 1802,89 15 20,3 1676,4 838,5 98-112 1674,79 15 20,6 1676, 4 838,5 98-112 1674.79 I 15,7 497,3 Ismeretlen artefaktum II 17,75 1288,9 Ismeretlen artefaktum A 220 nm hullámhosszon detektált peptidminták nem mutattak különbségeket a natív lizozim esetében (ábra 4-10 A) és HEWL-t mtgázzal 30 percig 40 ° C légköri nyomás vagy magas hidrosztatikus nyomás alatt (4-10. Ábra B és C). Ez azt jelezte, hogy a 81-et a HEWL kezelésére használták
4 Eredmények és vita A 1202,2 m/z B 817,5 m/z C 1364,9 m/z 84
4 Eredmények és megbeszélés D 1010,7 m/z E 1507,0 m/z F 1017,7 m/z 4-12. Ábra: A hat azonosított izopeptid szekvencia (A - F) tömegspektruma különböző retenciós időkben végzett triptikus emésztés után (lásd a táblázatot) 4-9, mtgázzal 30 percig 600 MPa-on, 40 vagy 60 C-on kezelve) és izopeptid-fragmenseikkel (a számok az AA helyzetére utalnak a HEWL-szekvenciában) 85
4 Eredmények és vita a kezeletlen HEWL feléről. A térhálósodás növekvő foka így egyrészt késlelteti a magok (lapos emelkedés), másrészt a fibril növekedést (alacsony maximális érték). A fibrillációs potenciál vizsgálata megerősíti a második elmélet (Johnson és mtsai, 2005 és Booth és mtsai, 1997) korábban kifejtett elvárásait a gátolt fibrillációs hajlamról. ABC 4-33. Ábra: ANS, kongói vörös és ThT vizsgálatok (A - C) eredményei kezeletlen és térhálós HEWL-sel (LMW - 2% HEWL, 40 U mtgáz/g fehérje 40 C-on, térhálósodás mértéke: 8,5% és HMW - 3% HEWL, 160 U mtgáz/g fehérje 60 C-on, térhálósodás mértéke: 65%) 2,2 pH-jú, 55 ° C-on 96 órán át tartó inkubálás után. A különböző festékrendszerekkel bemutatott mérések mellett vizuálisan is megállapítható volt, hogy enyhén térhálós állapot (LMW) finom, felhős csapadékká csapódik le, míg a kezeletlen HEWL durva aggregátumokat képez (4-34. ábra). Az erősen térhálós HEWL (HMW) oldatában az enyhén növekvő jelek ellenére az idő egyetlen pontján sem volt látható csapadék, feltehetőleg nem érték el a kicsapáshoz szükséges fibril koncentrációt. 119
11) négy ciklus után érhető el vákuummal vagy anélkül. 4.6.2 A képződött izopeptidek azonosítása A vákuum (ZLCL) alkalmazásával és anélkül végzett sikeres termikus térhálósodás után tisztázni kell az érintett izopeptidek kérdését. Mint már említettük, elméletileg két különböző dipeptid keletkezhet (Simons et al., 2002). A lizinből (Lys) és a 145-ből