ÉRTEKEZÉS a doktori fokozat megszerzéséhez a kémia tanszéken

1 Az orto-tirozin és a 3- (4-hidroxi-fenil) -propionsav aminosav-radiolízis-termékeinek meghatározása a fehérjében gazdag élelmiszerek γ-besugárzásának bizonyítékaként ÉRTEKEZÉS doktori fokozat megszerzéséhez a Hamburgi Egyetem Kémiai Tanszékén a Biokémiai és Élelmiszerkémiai Intézet - Élelmiszerkémiai Tanszék a Hamburgi Egyetemen Jana Huňková a Kladno Hamburg 23-ból

értekezés

2 Jelen munkát 1998 októbere és szeptember 22 között végeztük dr. Professzor irányításával. Dr. Hans Steinhart a Biokémiai és Élelmiszerkémiai Intézetben - Élelmiszerkémiai Tanszék. 1. bíráló: Prof. Dr. Dr. Hans Steinhart 2. bíráló: Prof. Dr. Bisping

3 Köszönetnyilvánítás Ezen a ponton szeretnék köszönetet mondani mindenkinek, aki támogatott a dolgozat elkészítésében: Prof. Dr. Dr. Szeretnék köszönetet mondani Hans Steinhartnak a téma biztosításáért és a nagy támogatásért. Prof. Dr. Köszönöm Bispingnek, hogy átvette az előadást. Dr. Ezúton szeretnék köszönetet mondani Thomas Simatnak a folyamatos beszélgetési hajlandóságért és együttműködésért, amely hozzájárult e munka sikeréhez. Szeretnék köszönetet mondani a Hamburgi Egyetem Élelmiszerkémiai Tanszékének minden kollégájának a jó együttműködésért. Szeretnék köszönetet mondani a Beiersdorf AG-nek és a GAMMASTER GmbH-nak a minták besugárzásáért. Köszönetet mondok a Daimler-Benznek és a H. Wilhelm Schaumann Alapítványnak e munka pénzügyi támogatásáért. Köszönöm szüleimnek a kimeríthetetlen türelmet. Szeretnék köszönetet mondani Ruth, Jiří, Robert, Britta, Astrid, Kerstin, Lui és Marijana barátaimnak a munka kijavításáért és egyéb sokszínű támogatásért.

4 Rövidítések listája 4 Rövidítések listája 3,2-HPPA 3,3-HPPA 3,4-HPPA λ Ex λ Em AP-ESI BgVV CV Em ESR EU Ex FAO FIA FL FLD GC HCl HPLC IAEA IS kgy LMBG M m/z MeCN MeOH min MS MSD MW n 3- (2-hidroxi-fenil) -propionsav 3- (3-hidroxi-fenil) -propionsav 3- (4-hidroxi-fenil) -propionsav Gerjesztési hullámhossz Kibocsátási hullámhossz Légköri nyomás Elektrospray ionizációs Szövetségi Fogyasztóvédelmi Egészségvédelmi és Állatgyógyászati ​​Intézet Spektroszkópia Spektroszkópia Európai Változat és Mezőgazdasági Szervezet áramlásinjekció-elemzés Fluoreszcencia-fluoreszcencia-detektálás Gázkromatográfia Sósav Nagy teljesítményű Folyadékkromatográfia Nemzetközi Atomenergia Ügynökség Bio-standard Kilo Grey Food and Commod Act Molekuláris tömegarány Acetonitril-metanol percek Tömegspektrometriás tömegszelektív detektálás Átlagos minta száma

5 Rövidítések listája 5 n.n. n.b. NH 4-acetát NH 4-formiát NWG PE Phe RP RT SIM SPE TFA TL Tyr UV v/v WHO WFR nem detektálható nincs meghatározva ammónium-acetát ammónium-formiát detektálási határérték polietilén-fenilalanin fordított fázis szobahőmérsékletű egyionos monitorozás szilárd fázisú extrakció trifluorecetsav termolumineszcencia tirozin ultraibolya térfogat arány Egészségügyi Világszervezet helyreállítási aránya

6 Tartalom 6 Tartalom 1 BEVEZETÉS CÉLKITŰZŐ ELMÉLETI ELVEK Az élelmiszer besugárzása Az ionizáló sugárzás kémiai hatásai A besugárzás elsődleges hatása A besugárzás másodlagos hatása A besugárzás dózisának hatása A besugárzás dózisának hatása A dózis sebességének hatása a besugárzás alatt Az élelmiszer változása a fagyasztás közben O-TIROSIN MEGHATÁROZÁSÁNAK MÓDSZEREINEK FEJLESZTÉSE A kromatográfiai körülmények optimalizálása A detektálás optimalizálása Fluoreszcencia detektálás (FLD) Tömeg szelektív detektálás (MSD) Tisztítás fejlesztése Deproteinizáció Homogenizáció Az o-tyr elkülönítése szilárd fázisú extrakcióval -HIDROXIFENIL) -PROPIONESAV A kromatográfiai körülmények optimalizálása. 43

7 Tartalom-jegyzék A detektálás optimalizálása Tisztítás kidolgozása. Deproteinizáció A 3- (4-hidroxi-fenil) -propionsav izolálása és dúsítása folyadék-folyadék extrakcióval A 3- (4-hidroxi-fenil) -propionsav izolálása és dúsítása szilárd fázisú extrakcióval Validációs megbeszélés FENILANIN MEGHATÁROZÁSA ÉS P-tirozin fehérje-gazdag ételekben O-tirozin meghatározása γ-besugárzott fehérje-gazdag ételekben A hőmérséklet hatása O-tirozin meghatározása RT besugárzott fehérjében gazdag ételekben O-tirozin meghatározása fagyasztott, besugárzott fehérjében gazdag élelmiszerekben Dózis sebességének hatása Influenza besugárzás - az o-tirozin háttér-tartalmának üvegezése nem besugárzott mintákban A fenilalanin-tartalom és az o-tirozin sugárzás által okozott képződése közötti kapcsolat 3- (4-HIDROXIPENENI) -PROPIONSAV MEGHATÁROZÁSA γ-besugárzott fehérje-gazdag élelmiszerekben a p-tirozin tartalma és a sugárzás okozta 3- (4-hidroxi-fenil) -propionsav képződése MEGBESZÉLÉS ÖSSZEFOGLALÓ - ÖSSZEFOGLALÓ Összefoglaló Összefoglaló IRODALOM. 82

9 Tartalom-jegyzék Anioncserélők Eljárás validálása a 3- (4-hidroxi-fenil) -propionsav meghatározására A 3- (4-hidroxi-fenil) -propionsav meghatározása γ-besugárzott fehérjében gazdag élelmiszerekben Élelmiszerek γ-besugárzásának eredményei A 3- (4-hidroxi-fenil) -meghatározása - propionsav-kromatogramok. 125

14 1 Bevezetés 14 ugyanazok az oxidációs termékek reagálnak. A γ-besugárzott fehérjében gazdag és egyben alacsony zsírtartalmú ételek azonosításának új megközelítése felajánlja az új potenciális 3,4-HPPA sugárzási marker meghatározását. Szűrés alapján KLEEBERG (22) felfedezte ezt az aminosav-radiolízis terméket különféle y-besugárzott fehérjében gazdag ételekben, például az Északi-tengeri garnélában, a csirkemellben és más garnélarákban. Ez a sugárzási marker szobahőmérsékleten és fagyasztott besugárzott élelmiszerekben egyaránt kimutatható volt. Jelentős különbségeket találtunk a nem besugárzott és besugárzott minták 3,4-HPPA szintje között. A 3,4-HPPA-t HPLC/FLD alkalmazásával határoztuk meg. Ez az eljárás mindeddig nem volt használható rutinszerű eljárásként.

16 3 Elméleti alapok 16 3 Elméleti alapok 3.1 Élelmiszerek besugárzása Élelmiszerek besugárzásához háromféle sugárzás megengedett (CODEX ALIMENTARIUS, 1984): a 6 Co radionuklid γ-sugarai (mesterségesen 59 Co-ból állítják elő, két γ-kvantum is 1,17 MeV és 1,33 MeV energiával bocsátanak ki) a 137 Cs radionuklidok γ-sugarai (maghasadásból egy viszonylag alacsony, 66 MeV energiájú γ-kvantum bocsát ki) β-sugarakat 1 MeV röntgensugár (az elektrongyorsító szekunder sugárzása) 5 MeV energiáig. Élelmiszer besugárzáshoz leggyakrabban γ-sugarakat használnak, mivel a anyag behatolási képessége a β-sugarakhoz képest nagy, ezért kiválóan alkalmas raklapokon lévő termékek besugárzására. (DIEHL, 1995). A sugárzás alkalmazási területétől függően különböző, 5 és 1 kgy közötti sugárzási dózist alkalmaznak. Az 1 kgy feletti nagy dózistartomány nem engedélyezett a kereskedelmi célú élelmiszerek számára, de speciális célokra használják sterilizálásra. Néhány alkalmazási területet a megengedett legnagyobb sugárzási dózisokkal a 2. táblázat sorol fel (NAÜ, 2.).

18 3 Elméleti alap 18 radiolitikusan megosztott, a következő radiolízis-termékek lényegében előfordulnak (4. egyenlet) (DRAGNIC és DRAGNIC, 1963, VON SONNTAG, 1987, DODD, 1995): H 2 O OH + e - aq + H + H 3 O + (4. egyenlet) A sugárzás másodlagos hatása Az ionizáló sugárzás elsődleges hatása által képződött szabad gyökök nagyon reaktívak és reagálhatnak egymással vagy az élelmiszer-összetevőkkel, ami a sugárzás másodlagos termékeihez vezet. A kapott faj tovább reagálhat a következőképpen (5., 6., 7. egyenlet): R + H RH kombináció (5. egyenlet) R + R RR dimerizáció (6. egyenérték) RH + + e - aq RH elektronelfogás (egyenérték 7) ) A hidroxil gyökök, mint a víz elsődleges radiolízis termékei, erős oxidatív hatást fejtenek ki. Ezek különösen reaktívak a telítetlen vegyületekkel és az aromás gyűrűkkel (KARAM és SIMIC, 1989, WANG et al., 1993). Amikor egy OH-gyök megtámadja a Phe-t, az hozzáadódik az aromás gyűrűhöz, és négy lehetséges köztiterméket képez (1. ábra). Közülük három (1, 2, 3) a hidroxi-Phe képződéséhez vezet, míg az Ipso forma (4) ismeretlen termékekhez vezet (WANG et al., 1993). 1. ábra: A hidroxi-Phe gyökök képződése primer és szekunder hatások révén

23 3 Elméleti alapok 23 Az emésztési funkciók normalizálása (GUTSCHMIDT, 1964). Enzimatikusan szabad zsírsavak szabadulnak fel a lipidekből. Kialakulásuk hőmérsékletfüggő és alacsonyabb hőmérsékleten lassabb, mint magasabb hőmérsékleten. Az enzimeket a fagyasztási folyamat általában nem pusztítja el. A hőmérséklet emelkedésével ismét teljesen aktívak lehetnek. Zsírromlási enzimek, pl. A lipázok és lipoxidázok alacsony hőmérsékleten is aktívak, és zsírbontási termékek (aldehidek, ketonok, savak, peroxidok) képződéséhez és foszfatidok lebomlásához vezetnek (HERRMANN, 197).

31 5 Módszerek kidolgozása az o-tirozin meghatározására 31 3 Hullámhossz (nm) gerjesztés maximális emisszió maximális ph értéke 5. ábra: A ph érték hatása a gerjesztésre és az emissziós maximumra A fluoreszcencia intenzitás optimalizálása A Tyr izomerek fluoreszcens tulajdonságai a ph értéktől függenek . Emiatt megvizsgálták a puffer pH-értékének az o-tyr fluoreszcencia intenzitására és így a kimutatás érzékenységére gyakorolt ​​hatását. Erre a célra a foszfátpufferben lévő 1,5 és 9,3 közötti pH-értékű o-tyr oldatokat fluorimetriásan mértük (λex = 275 nm, λem = 35 nm). Megállapították, hogy a fluoreszcencia intenzitása a 4-5-ös pH-tartományban éri el a maximumát (6. ábra). Fluoreszcencia intenzitás (%) ph érték 6. ábra: Az o-tyr fluoreszcencia intenzitásának függése a ph értéktől A következő eljárást alkalmaztuk a foszfátpufferrel kapott eredmények átvitelére a vizsgált mobil fázisokba. Egy o-tyr megoldás a HEIN et al. (2) felhasznált eluenseket, 1% TFA-t (pH 1,8), szintén fluorimetriásan mértünk (λex = 275 nm, λem = 35 nm). Az O-tyr-et 5 mol/l NH4-formiát oldatában, pH 3, 4 és 4,5 mellett is vizsgáltuk. A maximális fluoreszcencia intenzitást 4-es pH-értékű NH4formate pufferban oldott o-tyr oldattal kaptuk