Fehérjék elválasztása tömegspektroszkópiához - LABO ONLINE
Válasszon külön fehérjéket a tömegspektroszkópiához
Egy egyszerű becslés több méréssé válik
A kétdimenziós kapilláris elektroforézis lehetővé teszi a gélelektroforézissel elválasztott fehérjék online jellemzését tömegspektrometriával. Ezt a módszert írták le a szerzők a LABO cikkében.
A fehérjék méretük szerinti szétválasztására szolgáló gélelektroforézist 50 évvel ezelőtt vezették be [1], és ez a fajta legelterjedtebb elválasztási technika lett. A fehérjékkel komplexet képező nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) adunk az elemzendő fehérje vagy fehérje keverékhez. Az SDS-fehérje komplex eredő negatív töltése fedi a fehérje belső töltését, és arányos a fehérje méretével. Ennek eredményeként a hasonló töltés/tömeg arányú komplexeket elméletileg csak méretük alapján választják el elektromos mezőben egy elválasztó gél, általában egy poliakrilamid gél (PAGE). Ha összehasonlítjuk az elemzendő fehérjék migrációját az ismert tömegű fehérjék migrációjával, az ismeretlen tömeg extrapolációval becsülhető meg. Az SDS-PAGE-t a fehérjetömegek meghatározására és a komplex fehérjeelegyek méretük alapján történő szétválasztására használják.
A viszonylag magas laboratóriumi és időigény miatt ezt az elemzési technikát úgy optimalizálták, hogy az elválasztás már ne elválasztó ágyban, hanem kvarcüveg kapillárisban (CE (SDS)) történjen. Ennek a kapillárisnak a belső átmérője többnyire 50 um, és elválasztó gél pufferrel van feltöltve. Ez abban különbözik az SDS-PAGE-ban szokásosan alkalmazott elválasztó géltől, hogy vízoldható lineáris vagy csak kissé térhálósított polimereket használnak (térhálósított polimerek helyett) annak érdekében, hogy a kapillárisban leválaszthassák az elválasztó gél puffert [2]. A kapilláris szétválasztása így automatizálható, és növelhető a reprodukálhatóság. A kapilláris szétválasztásának másik fontos előnye az online detektálás UV-abszorpcióval vagy fluoreszcenciával. Ez lehetővé teszi kvantitatív kimutatásokat, és az elválasztott fehérjék időigényes rögzítése és festése, mivel SDS-PAGE-val már nem szükséges.
A cikk témái
A CE-t (SDS) széles körben használják a biofarmáciai iparban a terápiás fehérjék, például antitestek tisztaságának és bomlástermékeinek tesztelésére és jellemzésére. Az elemzés középpontjában tehát a felmerülő töredékek szétválasztása és számszerűsítése áll. Ezen fragmensek azonosítása egy másik fontos pont, mivel befolyásolhatják a terápiás fehérje hatékonyságát és ezáltal a beteg biztonságát.
Pontatlan tömegmeghatározás extrapolációval
Az azonosítás óriási kihívásnak bizonyul. Mivel a CE (SDS) szétválasztási hatékonysága gyakran nem elegendő, több töredék elrejtéséhez vezethet egy csúcs mögött. Ez megnehezíti a csúcsok hozzárendelését a töredékekhez tüskés kísérletek segítségével (a már azonosított fragmensek hozzáadásával és a csúcsfelület növekedésének megfigyelésével). A becsült fehérjetömeg révén történő extrapolációval történő azonosítás szintén nem lehetséges. Mivel függetlenül attól, hogy az SDS fehérje szétválasztása a kapillárisban vagy a polimerizált gélben történik-e, a tömeg meghatározása pontatlan. Ezenkívül a megkötött SDS és a fehérje aránya a fehérje szekvenciájától és szerkezetétől függően változhat, ezáltal a fajlagos tömeg még jobban eltérhet a valós tömegtől [3 - 4].
A pontatlan tömegmeghatározás nem teszi lehetővé a szennyeződések egyértelmű azonosítását. Ezen fragmentumok pontos tömegének tömegspektrometriával (MS) történő meghatározásával azonban lehetővé válik az azonosítás. Sajnos a CE (SDS) közvetlen összekapcsolása nem lehetséges, mivel a nagy viszkozitású elválasztó gél puffer dextránt és nem illékony komponenseket, például borátot tartalmaz, de mindenekelőtt a felületaktív SDS-t, ami a fehérje teljes elnyomásához vezet az ionizációs folyamatban [5]. Ennek a CE (SDS) módszernek az átméretezése egy esetleges frakciógyűjtésre egy későbbi offline mintakészítéssel az MS kompatibilitás szempontjából nem lehetséges a kis térfogatok és a nagyon viszkózus elválasztó gélpuffer miatt.
Online tömegspektrometria kétdimenziós kapilláris elektroforézissel
Az online MS-csatolás megközelítése azon alapul, hogy kapilláris zóna elektroforézis (CZE) formájában egy második elválasztási dimenziót kapcsolunk a CE (SDS) elválasztás és az MS között (1a. Ábra) [6]. Ez lehetővé teszi az MS-kompatibilis komponensek elválasztását az analitól. Az előző elválasztáshoz szükséges nagyon stabil SDS-fehérje komplex megoldásához további minta-feldolgozás szükséges. Az SDS-fehérje komplex ezen dekomplexumához ezért online stratégiát dolgoztak ki a második elválasztási dimenzióban. Ez egy szerves oldószer (itt metanol) és egy kationos felületaktív anyag (itt cetil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB)) együttinjekciójából áll, amelyet az SDS fehérjekomplex előtt vagy után helyeznek el a második elválasztó dimenzió kapillárisában.
Az általános elválasztás (SDS) összekapcsolása az első elválasztási dimenzióban a CZE-vel a második elválasztási dimenzióban egy négy csatlakozású nanoliteres szelepen (VICI) keresztül történik. Ezzel a szeleppel nagy (kb. 15 kV-ig terjedő) feszültséget lehet alkalmazni, amely a szétválasztáshoz szükséges. A nanoliter tartományban lévő belső mintahurok (4, 10 vagy 20 nl) lehetővé teszi ezeknek a nagyon kis mennyiségeknek az egyik dimenzióból a másikba történő átvitelét.
Az ép, termikusan megterhelt antitest fragmenseinek mérését a kétdimenziós kapilláris elektroforézis rendszerrel a 2. ábra mutatja. Lehetőség volt mindkét csúcs tömegspektrumának előállítására a CE (SDS) dimenzióban. Nyilvánvalóvá vált, hogy az egyes CE (SDS) csúcsok alatt nemcsak egy, hanem több fragmens is el van rejtve. Az 1. csúcshoz (2. ábra, kék) az 1C fragmentum (23439,4 ± 1,5 Da) hozzárendelhető az antitest könnyű láncához. Az 1B fragmens, amelynek tömegkülönbsége 103,7 Da az 1C könnyű lánchoz képest, a cisztein C-terminális hasításának és az 1A a víz további eltávolításának tudható be. A második CE (SDS) csúcshoz (2. ábra, zöld) szintén három antitestfragmens volt. A 2C csúcs 47638,2 ± 0,7 Da tömegét Fab-fragmensként azonosítottuk. Az utolsó kettő (T-H, ∆M = 238,2 Da) vagy három aminosav (K-T-H, ∆M = 366,2 Da) eliminációja a víz eltávolításával ebből a Fab-fragmensből a 2B és 2A tömegcsúcsokat eredményezi.
Következtetés és kilátások
Az itt bemutatott kétdimenziós kapilláris elektroforézis módszerrel lehetőség van a korábban CE (SDS) -vel szétválasztott fehérjék online tömegspektrumának megszerzésére további minta előkészítés nélkül. A pontos méretekkel lehetőség van a biofarmáciai termékek szennyeződésének azonosítására és a megfelelő gyógyszerek gyártásának folyamatoptimalizálására.
Irodalom:
[1] Laemmli Nature 1970, 227, 680-685.
[2] Zhu és mtsai. Anal Chim Acta. 2012, 709, 21-31.
[3] Guan és mtsai. Sci Rep 2015, 5, 13370.
[4] Rath és mtsai. Proc Natl Acad Sci, USA, 2009, 106 (6), 1760-1765.
[5] Rundlett és mtsai. Anal Chem 1996, 68 (19), 3493-3497.
[6] Römer és mtsai. Anal Bioanal Chem, 2019, 411 (27), 7197-7206.
SZERZŐI
Jennifer Romer 1
Cristina Montealegre 1
Bernd Moritz 2
Steffen Kiessig 2
Christian Neusüß 1
1 Aalen Egyetem, kémia tanszék
2 F. Hoffmann-La-Roche Ltd, Bázel, Svájc