Fehérjetisztítás - Biológia
Fehérjetisztítás (szintén Fehérje tisztítása) egy vagy több fehérje dúsításának és tisztításának folyamatára utal egy komplex biológiai keverékből vagy több biomolekulát tartalmazó oldatból. Ez a dúsítás több egymást követő tisztítási lépésben történhet különböző tisztítási módszerek alkalmazásával, amelyek eredményességét (az értelmes sorrendet) és hatékonyságát (a tisztítás mértékét) analitikai módszerekkel ellenőrizzük és számszerűsítjük.
Elválasztási elvek
A fehérjék szétválasztásához ki kell használni a szekvencia és a sajátos szerkezet miatt eltérő jellemzőiket. Az ioncserés kromatográfiában és az izoelektromos fókuszálásban ez az izoelektromos pont, az SDS-PAGE-ban a molekulatömeg és a transzláció utáni módosítások, a méretkizárásos kromatográfiában és a centrifugálásban a molekulatömeg és a konformáció. Az izopiknikus centrifugálás a sűrűség alapján szétválik. Az affinitáskromatográfia a szelektív ligandum iránti affinitás vagy a megfelelő disszociációs konstansok különbségeit használja fel. A hidrofób, a reverz fázis és a poláris kromatográfia a különféle kitett poláros aminosavak polaritása és a transzláció utáni módosítások szerint különválik. A Hofmeister sorozatból származó kozmotróp sókkal [1], vízoldható szerves oldószerekkel vagy hőmérséklettel történő kicsapódás a megváltozott oldhatóságon alapul. Az extrahálószerrel (általában más fázisú) vagy a polietilénglikollal [1] történő extrakció az oldószerben vagy detergensben, így pl. B. Fenol, kloroform és izoamil-alkohol keverékei (kaotropokkal vagy anélkül, például guanidinium-tiocianáttal vagy anélkül), vagy a Triton X-114 4 ° C-on. [3] [4] [5] [6]
Általában több eljárást hajtanak végre sorozatban, a módszer kiválasztása a fehérje tulajdonságaitól, a későbbi eljárásokhoz tartozó, a módszertől függő, interferáló kísérő anyagoktól és az esetleges denaturációtól függ. A folyamat magasabb tisztítási fokai (vagy tisztítási tényezői) kisebb számú tisztítási lépést tesznek lehetővé, pl. B. a tandem affinitás tisztítással.
Mivel a tisztítandó fehérjéket, többnyire rekombináns fehérjéket, inaktiválás, denaturálás vagy proteolízis veszélyezteti a sejtek megszakadása során, a fehérje tisztítását gyakran 4 ° C-on hajtják végre proteázinhibitorok jelenlétében. Egyes proteázinhibitorokat csak akkor használnak, ha a tisztítandó fehérje funkciója nem sérül, vagy funkciójának fenntartása jelentéktelen, mivel kovalens kötéssel módosíthatják a fehérjét.
Elválasztási folyamat
Kromatográfia
- Ioncserélő kromatográfia (IEX)
- Méretkizárásos kromatográfia (SEC)
- Affinitáskromatográfia
- poláris kromatográfia
- Hidrofób interakciós kromatográfia (HIC) és fordított fázisú kromatográfia (RPC)
Elektroforézis
Kivonás és csapadék
- soros kivonatok
- soros csapadék
Szűrés
- dialízis
- Tangenciális áramlásszűrés
- Mikroszűrés
ülepedés
- Centrifugálás
- Leengedett vizsgálatok
- antitestek segítségével: MACS, gyöngyvizsgálatok és immunprecipitáció
Párolgás
Ellenőrzési eljárás
A fehérjetisztítás egyes szakaszait követően a tisztított fehérjéket jellemezzük és mennyiségileg meghatározzuk. A teljes tisztítás hatékonyságát az egyensúly határozza meg, bizonyos mértékű tisztítással (a tömegfrakció reciprokaként) a fehérjetömegtől, vagy - enzimek esetében - az enzimaktivitásokból is meghatározható a tisztítás mértéke, pl. B. a tisztított fehérje teljes tömegének és a kiindulási anyagban a kérdéses fehérje kiindulási tömegének hányadosa, vagy az aktivitásokkal képzett analóg hányados.