Gén expressziós elemzés - biológia

A A génexpresszió elemzése genetikai információk (génexpresszió) megvalósulásának vizsgálatára utal molekuláris biológiai és biokémiai módszerekkel. Használható mind egyedi átírásokhoz, mind a teljes transzkriptumhoz, és lehetővé teszi kvalitatív és kvantitatív megállapítások készítését a gének aktivitásáról. Míg az első esetben csak a vizsgálandó átirat szekvenciainformációját kell ismerni, a transzkriptóm elemzéséhez a transzkriptóm teljes szekvencia információjára van szükség.

A molekuláris biológiában több ezer gén aktivitása és expressziója mérhető egyszerre a génexpresszió-elemzés segítségével, amely lehetővé teszi a sejtfunkciók áttekintését. A génexpressziós profilok felhasználhatók például az osztódás aktív fázisában lévő sejtek azonosítására, vagy a sejtek reakciójának kimutatására egy adott kezelésre. Sok ilyen kísérlet megvizsgálja a teljes genomot, vagyis egy adott sejt minden génjét.

A DNS mikroarray technika [1] a korábban azonosított célgének relatív aktivitását méri. Szekvencia alapú módszereket, például a génexpresszió soros elemzését (SAGE, SuperSAGE) is alkalmazzák a génexpresszió elemzéséhez. A SuperSAGE különösen pontos, mert ez a módszer nem korlátozódik előre definiált génekre, hanem bármely aktív gént képes mérni. A következő generációs szekvenálási módszerek bevezetésével a szekvencia-alapú expresszió-elemzés egyre nagyobb népszerűségnek örvend a mikro-sugarak digitális alternatívájaként. Mindazonáltal a mikrosávokat gyakrabban alkalmazták, amint ezt a módszert 2006-ig 17 000 PubMed cikkben mutatják be.

• Kifejeződik egy gén egyáltalán a vizsgált körülmények között?
• Mely sejtekben történik expresszió (pl. In situ hibridizáció)?

• Mennyire nagy a kifejezésbeli különbség egy meghatározott referenciához képest?
  • egészséges és beteg sejtek
  • Vad típusú kontra mutáns sejtek
  • stimulálatlan és stimulált sejtek

A módszertől függően a különböző génexpressziós szintek termékeit elemzik:

Mód

• In-situ hibridizációval egy meghatározott gén/génkészlet szekvencia-specifikus RNS-ét detektálják a szövetben, és meghatározzák a lokális génexpressziós mintát.

• Az Northern blot módszerrel először az RNS-t izoláljuk és elektroforetikusan szétválasztjuk nagysága szerint egy gélben. A membránra való átvitele után (blottolás) a keresett RNS-szekvenciát jelölt próbákkal (radioizotópok, fluoreszkáló festékek) detektáljuk, amelyeket komplementer RNS-ből vagy DNS-ből készítünk komplementer kötés útján. Általános szabály, hogy csak kis számú szekvenciát vizsgálnak egyszerre.

• DNS-mikro- vagy makrosávokon a tenyészet/szövet sejtjeiből származó nagyszámú gén mRNS-mennyisége egyidejűleg meghatározható. Erre a célra az mRNS-t izoláljuk és átírjuk cDNS-be. Ebben a módszerben a detektálás a megjelölt cDNS (radioizotópok, fluoreszcens festékek) komplementer hibridizációjával történik a DNS tömb próbáival.

• A génexpresszió (SAGE) és különösen a SuperSAGE soros elemzésével elméletileg a sejt összes génjének expressziója nagyon pontosan meghatározható egy rövid szekvencia (az úgynevezett "tag" = címke) létrehozásával minden transzkriptumból, és a lehető legtöbbből ezeknek a címkéknek a sorozata. Az előny a mikrosugarakkal szemben az átírások sokkal pontosabb kvantifikálása, valamint az új átiratok (pl. Nem kódoló ribonukleinsavak, például mikroRNS-ek vagy antiszensz RNS-ek) azonosításának lehetősége, és korábban ismeretlen genomokkal rendelkező szervezetek vizsgálata (különösen a SuperSAGE-nál).

• A valós idejű kvantitatív PCR a polimeráz láncreakció (PCR) egyik változata. A reakcióelegyhez adott festékek vagy speciális próbák figyelik a termék koncentrációját a PCR során. A koncentráció időbeli változása lehetővé teszi a következtetések levonását a kérdéses nukleinsav kezdeti koncentrációjáról.

• A Western blot módszerrel a fehérjéket különféle tulajdonságok, például méret, elektromos töltés vagy izoelektromos pont tekintetében választják el, majd antitestekkel detektálják. Általános szabály, hogy csak kezelhető számú génterméket vizsgálnak egyszerre.

• A 2D gélek differenciálanalízise egyszerre akár 10 000 fehérje expresszióját teszi lehetővé. Ebből a célból a fehérjekivonatokat sejttenyészetekből/szövetekből nyerik, az izoelektromos pont és a molekulatömeg szerint kétdimenzióban elválasztják, és jelöléssel vagy különféle (fluoreszcencia) festési technikákkal detektálják és mennyiségileg meghatározzák. A különböző minták meghatározott intenzitásait összehasonlítjuk egymással, és így az expresszió viselkedését különböző körülmények között figyeljük.

• Fehérje tömbökben, a DNS tömbökhöz hasonlóan, bizonyos fehérjék mennyiségét vizsgálják. A kimutatáshoz a fehérjék és más molekulák közötti sok kölcsönhatást használják: B. Enzim-szubsztrát, antitest-antigén vagy receptor-messenger kölcsönhatás.

• Az elmúlt években a fehérje-keverékek tömegspektrometriai elemzése egyre fontosabbá vált. A "spektrális bőség" alkalmazásával megszámoljuk a fehérje darab peptideket, hasonlóan a SAGE-ban meglévő RNS-ek DNS-fragmenseihez, és így azok gyakoriságát meghatározzuk. Más módszerek a tömegspektrum bizonyos peptidjeinek jelintenzitását használják a frekvencia mérésére.

Számos módszer fluoreszcens festékeket használ, amelyek a próbákhoz vannak kapcsolva (RNS-próbák, antitestek stb.), És amelyeket fluoreszcens spektroszkópia vagy fluoreszcens mikroszkópia segítségével tesznek láthatóvá. Ez utóbbi a nagy térbeli felbontás előnyét kínálja. Ezenkívül radioaktívan jelölt próbákat is alkalmaznak, vagy olyanokat, amelyek összekapcsolt enzimek révén kromogéneket festékekké alakítanak.

Összehasonlítás a proteomikával

Az emberi genom körülbelül 25 000 gént tartalmaz, amelyek együttesen körülbelül 1 000 000 különböző fehérjét hoznak létre. Ez a változatosság főleg poszttranszlációs módosítások révén keletkezik, így egyetlen gén szolgálhat templátként egy fehérje sokféle változatához. Körülbelül 2000 fehérje [5] (a teljes mennyiség 0,2% -a) azonosítható egyetlen tömegspektrometriás kísérlet során. A sejt által termelt egyes fehérjék (proteomika) ismerete sokkal relevánsabb, mint az egyes gének által termelt mRNS mennyiségének ismerete. A génexpresszió-elemzés azonban a lehető legjobb áttekintést nyújtja, amely egyetlen kísérlet során elérhető.

Használja hipotézisek kidolgozásához és teszteléséhez

korlátozások

Nagy teljesítményű módszerek validálása

Mind a DNS-mikro-sugarak, mind a qPCR a komplementer nukleinsav-szekvenciák előnyös megkötését ("bázispárosítás") használja, és mindkét módszert gyakran egymás után alkalmazzák a génexpressziós profilok létrehozására. Míg a DNS mikro-sugarak nagy áteresztőképességgel rendelkeznek, hiányzik a qPCR magas kvantitatív pontossága. Ugyanakkor, míg néhány tucat gén expressziójának meghatározása szükséges qPCR-rel, a teljes genom megvizsgálható DNS-mikro-sugarak segítségével. Emiatt gyakran van értelme először félkvantitatív DNS-mikroszkópos elemzést végezni a jelölt gének azonosítása érdekében, amelyet aztán validálni és pontosabban kvantifikálni lehet a qPCR segítségével. További kísérletek, például a differenciálisan expresszált gének fehérjéinek Western-blottolása, segíthetnek a génexpresszió-elemzés eredményeinek alátámasztásában, mivel az mRNS-koncentrációk nem feltétlenül korrelálnak az expresszált fehérje mennyiségével.

Statisztikai analízis

Gén annotáció

Statisztikai módszerek segítségével megbízhatóan azonosíthatók azok a gének, amelyek termékei kísérleti körülmények között változnak. Az expressziós profilok értelmes értelmezéséhez elengedhetetlen tudni, hogy melyik fehérjét melyik gén kódolja és milyen funkciója van. Ezt a folyamatot gén annotációnak nevezzük. Egyes megjegyzések megbízhatóbbak, mint mások, és néha teljesen hiányoznak. A gén annotációs adatbázisok folyamatosan változnak, és a különböző adatbázisok ugyanazon fehérjéhez különböző neveket használnak, tükrözve a funkciója megértésének változását. A szabványosított génnómenklatúra használata elkerüli a különböző elnevezések problémáját, de az átírások pontos hozzárendelése a génekhez [13] [14] továbbra is fontos kihívás.

A szabályozott gének osztályozása

A differenciálisan szabályozott gének egy csoportjának azonosítása után a következő lépés az, hogy mintákat kell keresni az adott csoporton belül. Az e gének által kódolt fehérjék hasonló funkcióval rendelkeznek-e? Kémiailag hasonlóak? Hasonló cellarészekben helyezkednek el? A gén ontológia elemzése közös módszert biztosít ezeknek a kapcsolatoknak a meghatározására. A gén ontológia egy nagyon széles felső kategóriával kezdődik, például "anyagcsere-folyamat", majd ezeket kisebb alkategóriákra bontja, például "szénhidrát-anyagcsere", amelyek viszont specifikusabb alcsoportokra oszthatók, például "az inozitol és származékai foszforilezése". A gének biológiai funkciójukon, kémiai tulajdonságaikon és a sejtek elhelyezkedésén kívül más tulajdonságokkal is rendelkeznek. Például a géneket csoportokba lehet sorolni más génekkel való kapcsolatuk, betegségekkel való kapcsolatuk, illetve gyógyszerekkel vagy toxinokkal való kölcsönhatásuk alapján. A molekuláris aláírások adatbázisa (Molecular Signature Database) [15] és a Comparative Toxicogenomics Database (Comparative Toxicogenomics Database) [16] lehetőséget kínál a gének sokféle módon történő kategorizálására.

Mintafelismerés a szabályozott gének között

Ha a szabályozott géneket annak megfelelően rendezik, hogy mik és mit csinálnak, fontos kapcsolatok alakulhatnak ki a különböző gének között [18]. Például kaphat jelzést arról, hogy egy adott gén egy olyan fehérjét kódol, amely létrehoz egy enzimet, amely viszont aktivál egy olyan fehérjét, amely a listánk második génjét szabályozza. Ez a második gén lehet egy transzkripciós faktor, amely viszont egy másik jelölt génünket szabályozza. Ezeknek a keresztkapcsolatoknak a megfigyelésével feltételezhetjük, hogy ezek több, mint véletlenszerű asszociációk, és hogy ezek a gének mindegyike szerepel a listán, mert egy mögöttes biológiai folyamat részei. Másrészt az egymástól független és teljesen véletlenszerűen kiválasztott gének azt a benyomást kelthetik, hogy egy közös folyamat részei, bár ez nem így van.

Ok-okozati összefüggések

Minták használata a szabályozott gének felismerésére

Következtetések

A génexpresszió-elemzés új információt nyújt arról, hogy a gének hogyan viselkednek különféle körülmények között. A mikroarray technikák általánosságban megbízható expressziós profilokat hoznak létre [24]. Ezen adatok alapján új biológiai hipotéziseket lehet felállítani vagy a meglévő hipotéziseket ellenőrizni. E kísérletek terjedelme és összetettsége azonban gyakran különböző értelmezésekhez vezet. Sok esetben az expressziós profilok adatelemzése az adatok előállításához lényegesen több időt és erőfeszítést igényel, mint az eredeti kísérlet. Sok tudós számos statisztikai módszert és előzetes adatelemzést alkalmaz, és konzultál biostatisztikusokkal vagy más szakértőkkel a mikroarray technológia területén, mielőtt közzétenné a génexpressziós elemzések eredményeit. A sikeres kísérleti felépítés, a megfelelő számú biológiai replikátum és az ismételt kísérletek kulcsfontosságú szerepet játszanak a sikeres génexpressziós elemzések elvégzésében.

---