Gyorsított ateroszklerózis kiváltása egerekben A huzal-sérülés modellprotokoll (lefordítva
Összegzés
Ez a tanulmány invazív módszert ír le gyorsított atherosclerosis kiváltására egerekben. Más, elektromos vagy krio-indukálta sérüléseket alkalmazó módszerekkel összehasonlítva a mechanikusan kiváltott sérülés utánozza az emberi resztenózis állapotát a revaszkularizációs terápiák után, és ideális az érintett molekuláris mechanizmusok tanulmányozásához.
Absztrakt
Az ateroszklerózis egy proliferatív fibro-gyulladásos betegség, amely az artéria falában alakul ki, és hiányos véráramlást vagy véráramlási hiányt indukál. Ezen túlmenően az arteriosclerosis okkluzív trombus képződést vált ki a sérült érfal megrepedésével, amely a szívinfarktus vagy a stroke fő oka és a halál leggyakoribb oka. A kardiovaszkuláris téren elért eredmények ellenére sok kérdés megválaszolatlan marad, és további alapkutatások elengedhetetlenek ahhoz, hogy jobban megértsük az érelmeszesedésben szerepet játszó molekuláris mechanizmusokat és következményeit. A korlátozott klinikai vizsgálatok miatt reprezentatív állatmodellekre van szükség, amelyek szimulálják az ateroszklerotikus betegségeket, például a stent beültetése utáni neointimális képződést, a ballon angioplasztikát vagy az endarterectomiát. Mivel az egér számos előnyt kínál, és ez a legelterjedtebb modell a molekuláris folyamatok tanulmányozásához, a jelenlegi tanulmány az endotheliális denudáció invazív módszerét javasolja, amelyet drótkárosodás-modellnek is neveznek, amely reprezentatív az artériák neointima-képződésének emberi állapotára a revaszkularizációs eljárások után. van.
Bevezetés
Az egérmodell fő hátránya az érelmeszesedéses betegségnek kitett fő artériák (a carotis artéria, az aorta és a femoralis artéria) kicsi mérete, amelyekhez képzett műtéti ismeretekre és készségekre van szükség az erek manipulálásához és az invazív ateroszklerotikus plakk előidézéséhez. Ezért a gyorsított neointima képződésnek ebben a cikkben javasolt modelljét az endarterectomia vagy stentelés utáni restenosis összefüggésében lépésről-lépésre iránymutatással és javaslatokkal mutatjuk be az érdeklődő személyzet bevezetésének megkönnyítésére. További hátrány, hogy a normális artéria falán denudáció lép fel, és ezért a neo-intima képződése mérsékelt lesz a klinikai helyzethez képest. Az Apolipoprotein E Knockout (Apoe -/-) egerekben magas zsírtartalmú étrenddel elért magas koleszterinszint megfelelő gyulladásgátló környezetet teremt a neo-intima képződéséhez.
A műveletet sztereo mikroszkóp alatt hajtják végre. A carotis artériát medialis metszésen keresztül tesszük ki az elülső nyaki területen. A carotis artériáján és annak körüli anatómiai struktúrákat minimálisan manipulálják a műtét utáni gyulladás csökkentése érdekében. A carotis carotis bifurkációja szünetel. A felgyorsult neointima képződés kiváltása érdekében belső és külső carotis artériákat készítenek fel az áramlás lehallgatására és az azt követő gyakori carotis artériás elutasításra. Összefoglalva: a módszert az állatok műtéte terén minimális tapasztalattal rendelkező személyzet tanulhatja meg.
Jegyzőkönyv
Az ebben a cikkben bemutatott kísérleteket a német törvények és az európai állatgondozási irányelvek szerint hajtják végre. Az állatokat az Aacheni Egyetemi Klinika Laboratóriumi Állattudományi Intézetének állattartó intézményében tartják Prof. Dr. irányításával. R. Tolba és Dr. A. Teubner (állatjóléti tiszt) tenyésztette.
- Tartsa az egereket egy speciális nevelőegységben, hogy megfelelő hozzáférést biztosítson az élelemhez, valamint a speciális állatorvosi ellenőrzéshez és kezeléshez. Ha az állatokat harmadik fél mozgatja vagy veszi meg, kérjük, hogy az eljárás megkezdése előtt egy hétig tartson tartási időt.
- 6 - 8 hetes, 18-20 g nőstény etetés (opcionális) ApoE -/- egerek aterogén étrenddel (21% zsír, 0,15% koleszterin, 19,5% kazein, W/Wt) egy héttel azelőtt műtét és folytassa a diétázást, amíg az ateroszklerotikus plakkok elemzésére nem kerül sor.
3. Sebészeti előkészítés
- Távolítsa el az övvisszahúzókat, és tegye vissza az izomréteget és két zsírtestet fiziológiai helyzetbe.
- Zárja le a bőrt három külön 0/6-os varrattal, ha echokardiográfiai mérésekre van szükség. Ha képalkotás nem szükséges, használjon fémes kapcsokat a bőr bezárásához.
- Helyezze az egeret a bal oldali infravörös fény alá, amíg fel nem ébred. Ne hagyjon egy állatot felügyelet nélkül vagy más állatoknál, amíg az teljesen meg nem gyógyult.
- Jelölje ki az egeret a jövőbeni azonosításhoz a helyi rendszerrel. Kérje az állatjóléti tisztet a helyi létesítményben.
6. Az érelmeszesedés plakkjának elemzése
Reprezentatív eredmények
Az érelmeszesedéses plakkindukciós eljárás 15-20 percig tart, és minimális halálozási arányt mutat, elsősorban az eljárás során fellépő vérzés miatt. A műtét után az egerek 20-25 perc alatt felépülnek az érzéstelenítésből. A műtét után semmilyen fizikai rendellenességet, például bénulást vagy táplálkozási rendellenességet nem figyeltek meg.
A huzalsérülés deendothelializációt indukál, amely utánozza a vaszkuláris elváltozásokat a ballon-nedvesség vagy stent beültetés után. Közvetlenül a sérülés után a denuded érfalat egy vérlemezkék fedik le, amely közvetíti és elősegíti a monociták tapadását 12. A médiából aktivált simaizomsejtek szaporodnak és a neointimát alkotó intim terekbe vándorolnak. Más simaizomsejtek prekurzorai a vérből vándorolnak (becslések szerint 40%), és hozzájárulnak a neointimális növekedéshez. A plakkképződés a teljes endothelializáció után ér véget, általában 4 héttel a huzal sérülése után.
A neointima képződése Movat festéssel értékelhető. A plakk méretét minden filmre szoftver segítségével számítják ki, ahogyan a 2B. ÁbraLátható. A teljes lepedékméret (bal nyaki artéria) 70 000 és 100 000 m2 között változhat, míg a kontroll ér mérete (jobb nyaki artéria) 7 000 és 8 000 m2 között változhat. Ezek az értékek nagyban függnek a sebésztől. Ezért határozottan javasoljuk, hogy a kísérletek során ugyanazt a sebészt használja ugyanahhoz a vizsgálathoz.
A kialakult lepedék a stent restenosisára hasonlít, amely túlnyomórészt a közegből replikált és vándorolt simaizomsejtekből áll. stentben Az immunológiai festéssel meghatározott sejtösszetétel azt mutatja, hogy a simaizomsejtek tartalma 30-40% körüli, míg a makrofágok a sérült ér neointimáinak 15-25% -ában találhatók. A reendothelializáció mérhető az endoteliális marker festése után, és kiszámítható a lumen teljes kerületén festett kerület százalékában. Általános szabály, hogy az endothelializáció 3 hét után eléri a 80-90% -ot, és 4 hét után majdnem teljesnek kell lennie (2C. Ábra). A plakk növekedésének követése a fejlődés során ugyanazon elemzést meg lehet ismételni a huzalsérülés után az egyes időpontokban, az érdeklődéstől és a vizsgált témától függően (lásd: Asztal 1).
Vita
Ebben a bejegyzésben hasznos tippeket adunk a huzalsérülési eljárás elvégzéséhez még az állati műtét terén minimális tapasztalattal rendelkező alkalmazottak számára is. Ennek az eljárásnak a végrehajtása két kritikus lépésből áll: a külső nyaki artéria levágása és a vezeték behelyezése. Az elegendő maradékanyag biztosítása érdekében a külső nyaki artériában a metszést a kettéágazástól a lehető legmesszebb kell végrehajtani (1C. Ábra). A bemetszés nem lehet túl nagy, mivel fennáll a veszélye, hogy az egész hajót elvágja. A második kritikus lépés a vérzés nagy kockázata az arteriotomia során és a vezetőhuzal behelyezése, ha a véráramlást nem szabályozzák hatékonyan. Ezen túlmenően, ha a vezetődrót nincs megfelelően behelyezve a lumenedénybe, nem következhet be endotheliális denudáció vagy artériás repedés. Ennek elkerülése érdekében a vezetőhuzal felületét az üzemeltetés előtt gondosan csiszolni kell.
A protokoll optimalizálása érdekében a műtőasztal helyzete az egérfejjel a sebész irányában jobb láthatóságot, hozzáférhetőséget és irányítást biztosít a helyes vezetőhuzal-manipuláció érdekében. Ezenkívül a reprodukálhatóság növelése érdekében ugyanazt a vezetéket használja minden vizsgálatban. Mivel a huzalméret nem változik, fontos figyelembe venni és kiküszöbölni az egerek közötti összes lehetséges különbséget, ugyanazon nemű, korú és tömegű vizsgálat alkalmazásával, a vizsgálatban szereplő összes egér esetében. Ezt követően Evans-Blue folt segít a sebésznek meghatározni a denudáció hatékonyságát. A megfelelő felszerelés rendelkezésre állása az eljárás sikerének előfeltétele. A művelet végrehajtásához elengedhetetlen a 10-szeres sztereo mikroszkóp. A vezetőhuzal megfelelő előkészítése (pl. Polírozás) elengedhetetlen. Ezért határozottan javasoljuk, hogy a huzal előkészítését szakosodott műszaki személyzet végezze, ha rendelkezésre áll.
Ennek a naplónak számos hibaelhárítási lépése van. Ha a hasi artériát metszi a bifurkáció közelében, óvatosan kösse össze a külsőket a bifurkáció közelében, hogy ne következzen be vérzés. A külső carotis artéria nem látható vágáskor. Ezért vegye fontolóra a kétágazást a selyemvarrat szintjén. Gyűjtse össze a szakaszokat, amikor a selyemvarrat eltűnik. Ha a külső nyaki artéria metszése túl nagy és az ér elszakadt, ellenőrizze, hogy a carotis communis és a belső nyaki artéria véráramlása hatékonyan megszakad-e, és csipesszel próbálja megtalálni az ér nyitását. A vezetőhuzal behelyezése és lebontása után kösse össze az edényt a kettéágazás közelében. Vágás közben kezdje el gyűjteni, amikor a selyem eltűnik a varratból. Ha artériás repedés történik a vezetőhuzallal történő denudáció során, ellenőrizze mikroszkóp alatt, hogy a vezetődrót megfelelően van-e csiszolva.
Annak ellenére, hogy a huzalsérülési modell hasonlít a klinikai helyzetekhez, sok csoport az egerekben az őshonos ateroszklerózisra összpontosít, vagy invazív érelmeszesedés-indukciókat választ, például patkányokon vagy nyulakon végzett ballonos angioplasztikát, mivel nincs képzett személyzet, amely képes lenne kis léptékű állatműtétek elvégzésére. A nyulak/patkányok alkalmazásának előnyei ellenére, pl. Például miniatürizált felszerelés nélkül sem a patkány, sem a nyúl modellek nem kínálnak sokféle különféle knock-out törzset a neointimális növekedésben és az in-stent trombózisban szerepet játszó molekuláris mechanizmusok tanulmányozására.
A denudációt a normál artéria falán hajtják végre, igaz, ateroszklerotikus háttérrel. Ezért a neointima képződése mérsékelt lesz a klinikai helyzethez képest. A preklinikai modellek nagy száma azt mutatja, hogy egyik modell sem felel meg az összes feltételnek, amely szükséges ahhoz, hogy feltárja az emberekben a patofiziológiához vezető sejt- és molekuláris mechanizmusokat (lásd: 2. táblázat).
A huzalsérülési eljárás befejezése után más biológiai és molekuláris elemzések végezhetők a sejtek, fehérjék, mRNS-ek, mikroRNS-ek, gének vagy más biomarkerek azonosítására, amelyek terápiás célpontként használhatók az ateroszklerózis, és különösen az érkárosodás utáni neointima képződés új kezelési stratégiáinak kidolgozására. . Ha rendelkezésre áll, a plakk növekedését nagyfrekvenciás ultrahanggal vagy más nagy felbontású képalkotó technikával lehet nyomon követni. Ezenkívül a technika elsajátítása lehetővé tenné az operátor számára, hogy a protokollt más invazív érelmeszesedési indukciós modellekhez igazítsa, mint például: B. Nyakörv elhelyezése, részleges ligálás vagy akár stent beültetés.