Haladó egérmodell a nem alkoholos steatohepatitis számára a 2. típusú cukorbetegséggel társítva
Összegzés
Leírnak egy egyszerű és megbízható, étrend által kiváltott kerítésmodellt az alkoholmentes steatohepatitis (NASH) számára, amelyet az állatok SPF-n kívüli elhelyezésével és egy speciális, magas zsírtartalmú étrend alkalmazásával érnek el. Leírjuk a máj- és zsírsejt-alcsoportok azonosítását az emberi immunrendszer összefoglalása céljából, az egerek környezeti csíráknak való kitettségével.
Absztrakt
Az elhízás összefüggésbe hozható krónikus, alacsony fokú gyulladással és inzulinrezisztenciával, ami hozzájárul a krónikus anyagcsere-betegségek, például a 2-es típusú cukorbetegség és az alkoholmentes steatohepatitis (NASH) növekvő előfordulásához. A legújabb kutatások kimutatták, hogy a gyulladáscsökkentő immunsejtek beszivárognak az elhízott hipertrófiás zsírszövetbe és a májba. Tekintettel az immunsejtek metabolikus homeosztázisban betöltött szerepére, sürgős szükség van a 2-es típusú cukorbetegség és a NASH kialakulásában bekövetkezett változásuk számszerűsítésére és jellemzésére. Az emberi NASH-ra jellemző patofiziológiai jellemzőket kiváltó állatmodellek azonban ritkák.
Ebben a cikkben részletes protokollt nyújtunk a májból és a zsírszövetből izolált immunsejtek részhalmazainak azonosításához a NASH megbízható egérmodelljében, amelyet nagy zsírtartalmú diétás egerek (HFD) nem specifikus kórokozóktól mentes alá helyezésével kapunk. (SPF) körülmények zár nélkül legalább hét hétig. Bemutatjuk az egerek sótlan körülmények között történő kezelését, a szövet emésztését és a makrofágok, a természetes gyilkos sejtek (NK), a dendritikus sejtek, a B és a T sejtek részhalmazainak azonosítását áramlási citometriával. Reprezentatív áramlási citometriás ábrákat mutatunk be SPF-HFD egerekből és nem SPF egerekből. A megbízható és értelmezhető adatok megszerzéséhez az antitestek használata, a szövetek emésztésének pontos és pontos módszerei, valamint a megfelelő fajta az áramlási citometriás kísérleteknél.
Az egerek fiziológiai antigén-expozíciójának helyreállítására irányuló beavatkozás nem szláv körülmények között történő elhelyezésével és a mikrobiális antigének nem specifikus expozíciójával releváns eszköz lehet az étrend által okozott immunológiai változások kapcsolatának tanulmányozásában. Elhízás és a kapcsolódó hosszú távú szövődmények.
Bevezetés
Az elhízás multifaktoriális betegség és a rizikófaktor a szívbetegségek, agyvérzés, alkoholmentes steatohepatitis (NASH), 2-es típusú cukorbetegség (T2D) és néhány rák kialakulásában. Az elhízás gyakorisága világszerte gyorsan növekszik. Ma 2,1 milliárd ember - a világ népességének csaknem 30% -a - elhízott vagy túlsúlyos 1. Az elhízással társult inzulinrezisztencia T2D-hez vezethet, amikor a kimerült hasnyálmirigy-béta-sejtek nem képesek kompenzálni a glükóz homeosztázis fenntartásához szükséges megnövekedett inzulinigényt 2.
A zsírszövet különböző sejttípusokból áll, beleértve az adipocitákat, az endothel sejteket, a fibroblasztokat és az immunsejteket. Az elhízás előrehaladása során az immunsejtek számának és aktivitásának megváltozása a 3, 4 hipertrófiás zsírszövet alacsonyabb szintű gyulladásához vezethet. Konkrétan azt találták, hogy a túlzott energiafogyasztás, krónikusan emelkedett vércukorszint, trigliceridek és szabad zsírsavak kíséretében adipocita hipoxiához, endoplazmatikus retikuláris stresszhez, a mitokondriális funkció károsodásához és fokozott citokin szekrécióhoz vezet, ami gyulladáscsökkentő zsírsejtek aktivációjához vezet 5,6. Az eddigi kutatások elsősorban a veleszületett immunitásra összpontosítottak, de újabban az adaptív immunsejtek (T és B sejtek) jelentek meg a glükóz homeosztázis fontos szabályozói. Gyulladásos funkciókkal rendelkeznek (beleértve a CD8 + T sejteket, Th1 és B sejteket) vagy mindenekelőtt szabályozó funkciókkal (beleértve a szabályozó T (Treg) sejteket, Th2 sejteket), és mindkettőjük súlyosbíthatja és megvédheti a 7,8 inzulinrezisztenciát. ., Szeptember 9-én
Az emberi immunállapotokat reprodukáló, fejlett egérmodellben a zsírszövet és a máj különböző immunsejt-alcsoportjainak tanulmányozására az inzulinrezisztencia és a NASH kifejlődésében egereket egyetlen ketrecbe helyeztünk fél steril körülmények között, gát nélkül. Az antigénnek kitett körülmények között elhelyezett egereknél NASH-szerű májpatológia alakult ki mindössze 15 hetes, magas zsírtartalmú étrend (HFD) után. Az életkornak megfelelő SPF egerekhez képest makrovesicularis steatosis, máj beszivárgás és immunsejtek aktiválása alakult ki.
Ez a kézirat robusztus áramlási citometriás elemzést ír le, amely meghatározza és megszámolja az egér zsírszövetéből és májából származó immunsejt-alcsoportokat a NASH modelljében. Az áramlási citometriás elemzés lehetővé teszi az egyes sejtek több paraméterének egyidejű meghatározását, szemben az RT-PCR vagy az immunhisztokémiai megközelítésekkel.
Összefoglalva, tanulmányunk egy rövid távú HFD egérmodellt nyújt az inzulinrezisztencia és a NASH kialakulásának és az azok mögöttes mechanizmusainak tanulmányozásához, amelyek szintén hűek az emberi állapothoz.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
Ezt a vizsgálatot a Nemzeti Egészségügyi Intézetek laboratóriumi állatok gondozásáról és használatáról szóló útmutatójának és az állatjóléti törvénynek megfelelően végeztük, intézményi állatjóléti bizottságunk felügyelete alatt. Az állatprotokollokat a Berlini Charité intézményi etikai irányelvei szerint, az Állami Egészségügyi és Szociális Hivatal jóváhagyta, és megfelelnek az ARRIVE irányelveinek.
1. A diéta által kiváltott steatohepatitis állatmodell
2. Reagensek és oldatok elkészítése
3. egysejtű szuszpenziók generációja
5. Áramlási citometria kompenzáció, megszerzés és kapuzás
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
A HFD-nek kitett egerek egér májában a T-sejtek extracelluláris festésének reprezentatív eredményeit a 3 A ábra mutatja. a HFD SPF egerekhez képest. Valójában az effektorraktárak nagyobb százaléka CD4 + és CD8 + T-sejtek detektálhatók HFD-nek kitett egerekben, míg az intrahepatikus naiv CD4 + és CD8 + T-sejtek szignifikánsan alacsonyabbak voltak az expozíciónál, mint az SPF egerek. 7. hét (3. ábra A).
Ezen eredmények igazolásához megvizsgáltuk az antigén expozícióval járó májgyulladásos választ 15 héten át táplált egerek májszeleteinek festésével 13. A HFD-nek kitett egerekben súlyos steatózist, beleértve a nagy lipidcseppek növekedését, amely makrovesic steatosishoz, lobelia gyulladáshoz, hepatocelluláris ballonozáshoz és megzavart lobulációhoz vezetett, míg csak néhány SPF egér mutatott enyhe zsírfelhalmozódást a májban (3. ábraB). Mint az ábrán3C jelentette, az NK-sejtek aránya a HFD-nek kitett egerek perigonadalis zsírszövetében magasabb volt, míg a HFD-SPF egereknél nagyobb volt a dendritikus sejtek aránya. Nem találtunk szignifikáns különbséget a makrofágok és a monociták között. Összességében ezek az eredmények megerősítik a HFD-nek kitett egerek súlyosabb májsteatózisát és a HFD-nek kitett és az SPF egerek közötti kisebb zsírszövetbeli különbségeket.
Asztal 1 mutatja az 1. táblázatban használt antitesteket. A B-sejtek, a makrofágok, az NK-sejtek, a dendritikus sejtek és a granulociták extraeculáris festésére használt áramlási citometriás elemzés során használt antitestek 2. táblázatLátható.
1. kép : Az elhízás áramlási citometriájának elemzésében használt kapuzási stratégia sematikus ábrázolása (1. táblázat). Először a sejteket szinguletten kapuzzuk. Ezután a törmeléket az elülső szórási terület (FSC-A) és az oldalsó szórási terület (SSC-A) felhasználásával és a megfelelő méret kiválasztásával távolítják el. A sejteket a CD45 expressziója is jellemzi. Az életképes sejteket élő/elhalt sejt markerekkel szelektáljuk, ami egy amin reakciófesték, amelyet nem élő sejteknek szánnak, hanem sérült membránokkal rendelkező sejteknek. A T-sejteket citotoxikus T-sejtekre (CD8 +) és T segítő sejtekre (CD4 +) osztottuk, és naiv (CD44 + CD62L-), központi tárolókra (CD44 + CD62L +), effektortárolókra (CD44 + CD62L -) osztottuk fel. és effektor (CD44 - CD62L +) T-sejtek. Végül a CD44 + sejteket a KLRG1, CD127 és PD-1 gátolják. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
2. kép : A zsírsejtek áramlási citometriájának elemzésében használt kapuzási stratégia sematikus ábrázolása (2. panel). A dendritikus sejtek kapuzása CD11b és CD11c expresszión alapult. A következő populációkat definiáltuk: B-sejtek, NK-sejtek, makrofágok, monociták és granulociták. Az adatokat elemzés után a megfelelő szoftverrel elemeztük. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
3. kép : Egér perigonadalis zsírszövetből és májból izolált T-sejtek reprezentatív áramlási citometriás elemzése. (A) Az egér májából származó CD4 + és CD8 + T sejteket 7 hetes HFD egerekből SPF alatt tartották és exponált körülmények között áramlási citometriával elemeztük. B.) a HFD SPF és a kitett egerek 15 hetes reprezentatív festése. Az immunsejtek és az élelmi rost hepatociták (nyílhegyek) behatolása szemlélteti a NASH-t. C.) Az elhízás veleszületett immunsejtjeinek aránya a leukociták százalékában HFD egerekben SPF alatt tartott vagy körülményeknek kitett 7 héten át. n = 6-10 egér csoportonként. A szignifikanciát kétirányú ANOVA többszörös mérések segítségével határoztuk meg. Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. * * P <0,01, * * * P 13 megváltozott. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
A steatohepatitis szoros kapcsolatban áll olyan anyagcserezavarokkal, mint az elhízás, az inzulinrezisztencia és a diszlipidémia 15. Számos tanulmány azt sugallja, hogy a zsírszövet gyulladása vezetheti a 2-es típusú cukorbetegség patogenezisét, beleértve a megváltozott sejtszámot mind a veleszületett, mind az adaptív immunrendszerben 4, 5, 16, 17. Ezenkívül az elhízásról kiderült, hogy modulálja az immunutak aktiválódását, ami máj szövődményekhez vezethet 18. Az elhízás és a májgyulladás immunsejt-fenotípusainak jellemzése iránti érdeklődés növekszik, mivel az immunsejtek minden egyes populációja másképp járul hozzá az inzulinrezisztencia és a steatohepatitis kialakulásához.
Ez a módszer részletes információt nyújt arról, hogyan lehet izolálni és számszerűsíteni az immunsejtek relatív mennyiségét a perigonadalis zsírszövetből és a májból. Ezenkívül a módszerek megmutatják, hogy a HFD-vel táplált egereket hogyan lehet tartani nem nedves körülmények között a steatohepatitis kiváltására. A protokoll felhasználható az immunsejtek funkcióinak tanulmányozására és a specifikus immunsejtek különböző szövetek közötti kapcsolatainak tanulmányozására mikrobiológiailag normalizált környezetben.
Jelen vizsgálatunkban a nem sepF egereket tápláló HRFD inzulinrezisztencia és steatohepatitis kialakulását eredményezte, míg a HFD SPF egereknél inzulinrezisztencia, enyhe máj steatosis, de az immunhisztokémia által meghatározott steatohepatitis nem alakult ki. Ezenkívül a zsír- és májpenész-alcsoportok jelentősen különböztek a HFD-nek kitett és az SPF-egerek között, ami megerősíti a különböző életkörülmények fontosságának megértését. Összegzésképpen meg tudtuk mutatni, hogy a közösség mikrobiális expozíciója drámai módon befolyásolhatja a C57Bl/6 egerek immunológiai tulajdonságait. Korábbi munkák kimutatták, hogy a bél mikrobiomjának sokféleségét és működését a táplálkozással összefüggő elhízás befolyásolja 19, 20, és hogy a bél gát funkciója és a bél permeabilitása az életkörülményektől függ 21. Egy hamarosan megjelenő kiadványunkban a bél kolonizációja és a zsír- és májgyulladás kapcsolatát szeretnénk megvizsgálni.
A javasolt módszerek tervezésénél több szempontot is figyelembe kell venni. Először is, minden áramlási citometriás vizsgálat egysejtű szuszpenziókat igényel, és a sejtek életképességét befolyásolhatja a szöveti mechanikus disszociáció mértéke és a szöveti enzimatikus emésztés időtartama. Az ebegitóp antitest roncsolásának elkerülése és a funkcionálisan életképes, disszociált sejtek hozamának maximalizálása érdekében figyelembe kell venni a szövet típusát, az állat életkorát, genetikai változásokat, az enzimek koncentrációját, a hőmérsékletet és az inkubációs időket.
Másodszor, protokollunkat optimalizáltuk a zsírsejt-gyulladásban és steatohepatitisben szenvedő, elhízott, HFD-vel táplált egerek különféle hatássejt-fenotípusainak számszerűsítésére. Mivel az immunsejtek számát, az immunsejtek számát és ezáltal a szövetek emésztésének minőségét befolyásolhatják a gyulladásos folyamatok, bizonyos kísérletekben az alkalmazott protokollt és a kollagenázt a máj vagy a zsírszövet kivételével más szövetekre kell optimalizálni. A boncolási módszereket, az inkubációs időket vagy a szövet emésztésére használt kollagenázt illetően. Harmadszor, a protokoll szempontjából fontos, hogy különböző kísérleti csoportokat vegyenek be naponta, hogy kiküszöböljék az áramlási citometriás vizsgálat napi változásának hatásait (hőmérséklet, inkubációs idők stb.).
Végül részletes protokollt nyújtunk be az egér adipózisának és a máj immunsejtjeinek fenotípusos jellemzéséhez áramlási citometriával, a NASH és az inzulinrezisztencia étrend által kiváltott állatmodelljében. Tekintettel az elhízáshoz és a metabolikus diszregulációhoz kapcsolódó veleszületett és adaptív sejtek összetett funkciójára és szabályozására, javasolt módszereinknek hozzá kell járulniuk ahhoz, hogy elmélyítsük a metabolikus homeosztázis kiegyensúlyozására szolgáló immunológiai mechanizmusokat. Így segítsen olyan emberi terápiák kifejlesztésében, amelyek helyreállíthatják a gyulladáscsökkentő immunválaszokat. Összességében a mellékelt állatmodell gyors és robusztus modellként szolgál az elhízással járó metabolikus szövődmények felmérésére, és más betegségmodellekre is alkalmazható.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.