Hyperhomocysteinemia és reproduktív patológia Repromed

hiperhomociszteinémia és a reproduktív patológia

Veaceslav Moşin, Alina Hotineanu, Adrian Creţu, Vitalie Scurtu, Iuliana Holban

Cikk a Rep. "Perinatológiai Közlönyében" megjelent. Moldova, 2014, 1. szám (61)

A hiperhomociszteinémia azt az állapotot határozza meg, amelyben a nem fehérje aminosav - a homocisztein - koncentrációja meghaladja a normális határértékeket. A folsavciklus génjeinek mutációi (MTHFR, MTR, MTRR) nagyban hozzájárulnak, különösen vitaminmentes étrend mellett, különösen a B komplexből. Jelenleg a hiperhomociszteinémia kockázati tényező a terhességi szövődményeknél, mint pl.: placenta repedése, preeclampsia, idegcsőhibák, intrauterin növekedési korlátozások, vetélések. Ezekkel kapcsolatban a homocisztein mérgező az erekre, és elindíthatja az érrendszeri szövődmények kaszkádját, beleértve a trombusképződést is. A betegek genetikai vizsgálata lehetővé teszi a hiperhomociszteinémia és a trombózis kockázatának megbecsülését, a megfelelő kezelés és a terhesség monitorozásával.

hiperhomociszteinémia

A homocisztein (Hcy) kéntartalmú, nem fehérje aminosav, hiányzik a természetes étrendből, és metabolikus köztitermék a transzmetilezési és transzkéntelenítési reakciókban - fontos reakciók a sejtek normális növekedésében, működésében és differenciálódásában [8]. A vérplazmában a Hcy különböző formákban található meg: a teljes homocisztein (tHcy) 70% -a fehérjéhez kötött formában kering diszulfid kölcsönhatások (főleg albumin) révén [19]; körülbelül 25% homocisztein dimerek formájában található, a többi (5%) - más tiolokhoz kapcsolódik, beleértve a ciszteint, a redukált Hcy-t és az oxidáltakat [22].

A Hcy plazma szintje az életkor előrehaladtával nő a Hcy metabolikus csökkenése miatt a vesékben. A nők alacsonyabb Hcy-szinttel rendelkeznek, mint a férfiak, részben a nemi hormonok (ösztrogén és progeszteron) és a menstruáció hatásának köszönhetően [20].

Optimális fiziológiai körülmények között a Hcy mennyiségét sejtszinten két alternatív anyagcsere út szabályozza: visszafordíthatatlan lebontás kéntelenítéssel vagy remetilezés metionin képződéssel [3]. A főként a májban és a vesékben előforduló kéntelenítés a Hcy szerinnel történő kondenzációjában áll, ami cisztationint eredményez, a cisztationin-β-szintáz enzim és a B6-vitamin kofaktorként való részvételével. A következő lépésben a cisztationin-γ-liáz cisztationinné és α-ketobutiráttá bontja le. A cisztein a kénatomdá oxidálódik, és szervetlen szulfátot képez a vizelettel. Másrészt a cisztein a glutation prekurzora - antioxidáns, amely nélkülözhetetlen a xenobiotikumok méregtelenítésében.

Alternatív megoldásként a Hcγ-t metioninná metil-5-metil-tetrahidrofolát (5-metil-THF) vagy betain-donor alkalmazásával remetilezzük [16]. Ily módon a Hcy-anyagcsere szorosan kapcsolódik a folátciklushoz: a metionin-szintáz enzim (MTR) katalizálja a metilcsoport átvitelét az 5-metil-THF-ből Hcy-be, metionin és THF (tetrahidrofolát) képződésével, amely reakció az eritrociták kivételével minden sejtben lejátszódik. Az MTR-hez kofaktor kobalaminra (Cbl) van szükség, és a képződött Cbl (I) MTR komplex megköti a metilcsoportot, ami metil-Cbl (III) MTR-t eredményez. Transzfer után a Cbl (I) MTR átalakul, és képes elfogadni egy másik metilcsoportot. Ugyanakkor a kobalamin kissé oxidálódik Cbl (II) formára, és a Cbl (II) MTR komplex inaktívvá válik. Egy másik enzim - metionin-szintáz-reduktáz (MTRR) - funkciója a Cbl (II) MTR komplex reduktív metilezéssel történő újraaktiválása [14].

Ezt követően a THF 5,10-metilén-THF-vé történő átalakulását az MTHFD1 enzim katalizálja, és az enzim feladata, hogy a metilcsoportot Hcy-remetilezéssé állítsa vissza. MTHFR amely az 5,10-metilén-THF-et 5-metil-THF-re redukálja, a kofaktor B2-vitamin (riboflavin).

1. ábra Homocisztein metabolizmus: metionin-remetilezési út és transz-kénezés útja olyan termékek képződésével, mint a cisztein és a szulfát

Hyperhomocysteinemia (HHcy)

A HHcy az enzimhiány és/vagy a vitaminok táplálkozási hiányának következménye, amely zavarja a metionin és/vagy a Hcy normális metabolizmusát. Az extracelluláris Hcy koncentráció növekedése mérgező a sejtekre és szövetekre, és elindíthatja az érrendszeri szövődmények kaszkádját [25]. A Hcy normál határai 5 és 15 μM között vannak [11]. Magasabb értékek társulnak a formákhoz: közepes (15-30 μM), közepes (30-100 μM) és súlyos (> 100 μM) HHcy [12]. A genetikai, metabolikus és környezeti tényezők között összetett kölcsönhatás van a homocisztein szintjének normális határokon belül tartása érdekében. Egy faktor változása vagy a tényezők kombinációja növelheti a tHcy (teljes homocisztein) szintjét. Steeed [25] szerint 4 olyan körülményt vizsgáltak, amelyek megmagyarázzák a HHcy kialakulását: 1) metioninban gazdag étrend; 2) vitaminhiány (B12, B6 és folát);
3) veseelégtelenség; 4) genetikai rendellenességek (az MTHFR, MTR, MTRR, CBS génekben).

2. ábra: Hyperhomocysteinemia faktorok (HHcy): 4 út a homocisztein akkumulációhoz

Vizsgáljuk meg őket részletesebben:

1) Az étkezés során kapott metionin mennyiségének fele átalakul Hcy-vé [7]. Állatkísérletek szerint a metioninban gazdag étrend B6, B12 vitaminok és folsavhiány jelenlétében növelheti az érelmeszesedés és a koszorúér-betegség kockázatát, míg a növényi ételekben és gyümölcsökben gazdag étrend normális határokon belül tartja a Hcy-szintet [1].

2) A B-komplex vitaminokból (B2, B6, B9, B12) származó kofaktorok részt vesznek a Hcy anyagcserét szabályozó enzimatikus reakciókban. Számos tanulmány kimutatta, hogy a hiperhomociszteinémiában szenvedő egyének koncentrációja nem megfelelő egy vagy több enzim-kofaktorban [23]. És a Hcy-koncentráció fordítottan arányos a folát, a B12-vitamin és a B6-vitamin plazmakoncentrációjával [10]. A folsav (a B9-vitamin oldható formája) szükséges a sejtosztódáshoz és a differenciálódáshoz, különösen a terhesség alatt. A folsavszármazékok a monokarbon szénatomok adományozói a purinok és a DNS és RNS pirimidin komponenseinek szintéziséhez, és a fémcsoport klónozásával részt vesznek az epigenetikus szabályozásban.

3) A vesék képviselik a Hcy-metabolizmus fő helyét, amelyek rendelkeznek a 3 enzimmel: MTR, CBS és cystationin-γ-liáz [9]. A veseelégtelenséget megnövekedett tHcy-szint kíséri, és Arnadottir tanulmányai fordítottan arányos kapcsolatot mutatnak a mért glomeruláris szűrési sebesség és a tHcy szintje között.

4) A Hcy-metabolizmus enzimjeiben előforduló genetikai rendellenességek a tHcy koncentrációjának növekedését okozhatják, és a változások súlyossága a génmutáció helyétől függ [25]. A Hcy-variabilitással kapcsolatos legelfogadottabb polimorfizmus a 677C> T az MTHFR génben, amely az enzimösszetételben Valát helyettesíti. Kang és mtsai. azonosította az MTHFR enzim egy olyan változatát, amelyet alacsony aktivitás és "hőre oldhatóság" jellemez [13]. Az enzimatikus aktivitás a heterozigóta CT és a homozigóta TT genotípusok esetében 35, illetve 70% -kal csökken [25], a termolabilis forma pedig a mérsékelt HHcy genetikai markere 677TT genotípusú egyéneknél (3). Ugyanakkor ez az összefüggés csak a nem megfelelő folátkoncentrációkkal együtt figyelhető meg. Guenthler (1999) tanulmányai kimutatták az E.coli modellben, hogy a FAD kötés gyengülése felelős az enzimatikus aktivitás csökkenéséért, a FAD elvesztése elleni védő szerepet pedig még a foláció is [6].

Az MTHFR gén 1298A> C polimorfizmusa a Glu és Ala cseréjéből áll. Lényeges, hogy sem a polimorfizmus homozigóta, sem heterozigóta állapota nem változtatja meg a plazma Hcy szintjét [15]. A C677T és A1298C heterozigóta vegyületének állapota azonban csökkent enzimatikus aktivitással, magas Hcy-szinttel és alacsony plazma-folát-koncentrációval jár [5].

Az MTRR gén 66A> G polimorfizmusában az izoleucin metioninnal helyettesített. Egyes tanulmányok szerint ez a polimorfizmus a DTN (idegcsőhibák) kockázati tényezőjeként szerepel [21].

Homocisztein és szív- és érrendszeri betegségek

A Hcy érfalra gyakorolt lehetséges negatív hatásainak első bizonyítékáról McCully számolt be 1969-ben [18]. Hasonló erekelváltozásokat észleltek 2 súlyos HHcy-ben szenvedő betegnél a Hcy-anyagcsere veleszületett hibái miatt, és a "Homocisztein-elmélet" feltételezi, hogy a Hcy és származékai mérgezőek az erekre. Másrészt a 24100 alanyra kiterjedő metaanalízis eredményei azt mutatják, hogy a homocisztein normalizálási terápia nem csökkenti a szívizom és az agy infarktusának kockázatát, ami azzal magyarázható, hogy ezek a tesztek a folsav felírásán alapultak [17]. A folátterápiával történő kiegészítés egyrészt előnyös, de az antagonista hatás a proliferáció és a gyulladás felgyorsítása - az ateroszklerotikus plakk kialakulásának alapvető folyamatai, elsősorban a folát anyagcsere szerepe miatt, amely monokarbon szénatomokat biztosít a purin és a pirimidein szintéziséhez a DNS szerkezetében. RNS [4].

A legújabb tanulmányok 3 kóros mechanizmust írnak le a Hcy által okozott vaszkuláris szövődmények hátterében: oxidatív stressz, endothel diszfunkció és vaszkuláris átalakulás - integrálva a "Toxikus triádba" [4].

3. ábra: Toxikus triád: A homocisztein által okozott érrendszeri megbetegedések hátterében álló kóros mechanizmusok.

A kutatások szerint Hcy elsősorban az érrendszeri endotheliumot támadja meg, és elindítja az érrendszeri szövődmények kaszkádját. Klinikai megfigyelések és állatkísérletek azonosították a Hcy lehetséges célpontjait: EC (endoteliális sejtek), VSMC-k (izomsejtek), kötőszövetek, vérlemezkék, koagulációs faktorok, lipidek, NO (nitrogén-oxid) szignál transzdukciós molekulák [25 ]. Nincs azonban egységes hipotézis, amely megmagyarázná, hogyan okozza Hcy az ér károsodását. A HHcy molekuláris és sejtes hatásait az 1. táblázat tükrözi.

1. táblázat: A hyperhomocysteinemia mechanizmusai

A HHcy molekuláris hatásai	A HHcy sejtes hatásai
Az NO (nitrogén-oxid) termelés csökkentése	Endothel diszfunkció
A rendelkezésre álló NO mennyiségének csökkentése	Az endothel sejtek vazorelaxációjának károsodása
Oxidatív stressz	Mitokondriális károsodás
Lipidperoxidáció	A simaizomsejtek szaporodása
gyulladás	Az extracelluláris mátrix lebomlása
koaguláció	A DNS és az RNS károsodása
Trombus képződés	apoptózis

Anyagok és metódusok: A kutatócsoport az Egészségügyi Központ betegei közül reproduktív problémákkal küzdött, beleértve a vetéléseket és a visszatérő vetéléseket. A genomi DNS-t speciális készletek (GeneJet Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit, Fermentas) után extrahálták perifériás vér leukocitákból. A vérmintákat eldobható EDTA csövekbe vénapunktúrával gyűjtöttük.

Az MTHFR C677T, az MTHFR A1298C, az MTR A2756G és az MTRR A66G polimorfizmusok genetikai vizsgálatához PCR/RFLP (láncpolimerizációs reakció és restrikciós fragmens hossza polimorfizmus) reakciókat hajtottunk végre az irodalom 2. cikkéből vett specifikus primerekkel. 27,24]. A genomi DNS-t Dream Taq polimeráz ("Fermentas", USA) segítségével amplifikáltuk a "TProfessional Basic 96" termociklusban (Biometra, Németország). A reakció körülményei az összes polimorfizmus esetében hasonlóak, kivéve a primer beállítási hőmérsékletét: 60,4 ° C az MTHFR C677T esetében, 61 ° C az MTHFR A1298C esetében, 58,4 ° C - MTR A2756G, 57,6 ° C - MTRR A66G, és a szokásos protokolli feltételek a következők: denaturálás kezdet 95 ° C-on - 3 perc, 33 ciklus: 94 ° C - 30 másodperc, 57,6 - 61 ° C - 30 másodperc, 72 ° C - 30 másodperc és végső megnyúlás 72 ° C-on - 5 perc.

Az amplikonokat 3 órán át 37 ° C-on korlátoztuk az egyes polimorfizmusokra specifikus restrikciós enzimekkel: Hinf I MTHFR C677T esetében, Mbo II MTHFR A1298C esetében, Hae III - MTR A2756G és Nde I - MTRR A66G.

A restrikciós termékek ellenőrzését PAAG (poliakrilamid) gélelektroforézissel végeztük 7,5% -os koncentrációban - 200 V hőmérsékleten 3 órán át. A gélt etidium-bromid oldattal festettük. Az eredményeket pedig az UV SOLO rendszeren (Németország) tekintették meg. A töredékméretek a 4. ábrán láthatók.

Ábra 4. A folátciklus gén polimorfizmusainak PCR/RFLP analízisének elektroforgramma:

A) MTHFR C677TM - 50 bp marker; 1 - amplikon (227 bp); 4 - 8 - normális homozigóta (205 bp); 2 - heterozigóta (205, 129, 76 bp); 3 - mutáció után homozigóta (129, 76 bp);
B) MTHFR A1298CM - 50 bp marker; 1 - amplikon (163 bp); 4 - normál homozigóta (56, 31, 30, 18 bp); 3, 5, 7 - heterozigóta (84, 56, 31, 30, 18 bp); 2 - homozigóta mutáció után (84, 31, 30, 18 bp);
C) MTR A2756G: 2, 3, 5, 6, 9 - normál homozigóta (421, 81 bp); 1, 4, 7, 8 - heterozigóta (421, 269, 152, 81 bp); 10 - mutáció után homozigóta (269, 152, 81 bp);
D) MTRR A66GM - 50 bp marker; 2-amplikon (145 bp); 5, 6 - normál homozigóta (145 bp); 4 - heterozigóta (145, 123, 22 bp); 3 - homozigóta mutáció után (123, 22 bp).

Eredmények és értékelésük: A genotipizálási eredményeket az 1 - 4. ábra mutatja be. A kapott eredmények valódiságának értékeléséhez a variációs statisztikák általánosan elfogadott képleteit használtuk a SISA program segítségével. Ebben az összefüggésben az allélok és a genotípus osztályok gyakoriságát Hardy-Weinberg képlete alapján számoltuk, és a genotípusok gyakoriságának összehasonlításához a Pirson-kritériumot alkalmaztuk - X 2 .

1. ábra: A genotípus osztályok gyakorisági eloszlása MTHFR C677T polimorfizmus alapján

2. ábra: A genotípus osztályok gyakorisági eloszlása MTHFR A1298C polimorfizmus alapján

3. ábra: Genotípusos osztályok gyakorisági eloszlása az MTRR A66G polimorfizmus szerint

4. ábra: Genotípusos osztályok gyakorisági eloszlása MTR A2756G polimorfizmus alapján

A megfigyelt genotípusok és az X 2 teszttel elméletileg elvárt gyakorisági eloszlásának összehasonlításakor a Hardy-Weinberg-egyensúlytól nem sikerült statisztikailag szignifikáns eltérést kimutatni egy vizsgált polimorfizmus esetében: MTHFR C677T (X 2 = 0,575; p> 0,05); MTHFR A1298C (X2 = 3,766; p = 0,052); MTR A2756G (X2 = 2,332; p> 0,05); MTRR A66G (X2 = 2230; p> 0,05);

1) A nagy mennyiségű homocisztein mérgező hatással van a vérerek endotheliumára, serkenti a trombusképződést.

2) A hyperhomocysteinemia a terhességi szövődmények kockázati tényezője különböző időpontokban, beleértve a preeclampsia-t, a placenta megszakadását, az intrauterin növekedési korlátozásokat és a vetéléseket.

3) A homocisztein és a folsav metabolizmusának génjeiben mutációk után végzett genetikai vizsgálatok lehetővé teszik a kockázat becslését és a megfelelő kezelés előírását.